Warta

Hatur nuhun pikeun ngadatangan Nature.com.Versi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan CSS kawates.Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun yén anjeun nganggo browser anu diropéa (atanapi nganonaktipkeun Mode Kasaluyuan dina Internet Explorer).Samentawis waktos, pikeun mastikeun dukungan anu terus-terusan, kami bakal ngajantenkeun situs tanpa gaya sareng JavaScript.
Sél kanker parantos mekarkeun sababaraha mékanisme pikeun ngatasi setrés sélular sareng teras maju.Protéin kinase R (PKR) sareng aktivator protéinna (PACT) mangrupikeun résponén awal anu ngawaskeun rupa-rupa sinyal setrés ngarah ngahambat proliferasi sél sareng apoptosis.Nanging, pangaturan jalur PACT-PKR dina sél kanker tetep teu dipikanyaho.Di dieu, urang manggihan yén lila non-coding RNA (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) langsung kalibet dina inhibisi jalur PACT-PKR jeung promotes proliferasi sél kanker.Ngagunakeun screening fungsional skala badag tina CRISPRi 971 kanker-pakait lncRNA, urang manggihan yén DARS-AS1 ieu pakait sareng proliferasi sél kanker nyata ditingkatkeun.Ku alatan éta, DARS-AS1 knockout ngahambat proliferasi sél jeung promotes apoptosis sél kanker dina rupa garis sél kanker in vitro tur nyata ngurangan tumuwuhna tumor dina vivo.Mékanis, DARS-AS1 langsung ngabeungkeut domain aktivasina PACT sareng nyegah interaksi PACT-PKR, ku kituna ngirangan aktivasina PKR, fosforilasi eIF2α, sareng ngahambat maot sél apoptosis.Sacara klinis, DARS-AS1 sacara lega dikedalkeun dina sababaraha kangker, sareng overexpression tina lncRNA ieu nunjukkeun prognosis anu goréng.Panaliti ieu ngajelaskeun pangaturan khusus kanker tina jalur PACT-PKR ku DARS-AS1 lncRNA sareng nyayogikeun udagan sanés pikeun prognosis sareng pengobatan kanker.
Kamampuhan pikeun adaptasi sareng setrés mangrupikeun ciri penting pikeun survival sél kanker sareng proliferasi.Proliferasi gancang sareng ciri métabolik kanker puncak dina lingkungan mikro anu parah - kakurangan gizi, hypoxia, sareng pH rendah - anu tiasa memicu jalur sinyal maot sél.Disregulasi gén sénsitip stres sapertos p535, protéin shock panas 6, 7, KRAS8, 9, sareng HIF-110, 11, 12, 13 sering dititénan dina kanker, ku kituna ngahalangan apoptosis sareng ngamajukeun kasalametan.
Protéin kinase R (PKR) mangrupa sénsor stress penting jeung subunit kinase tina faktor inisiasi eukariot 2α (eIF2α), régulator translasi nu numbu stress sélular jeung maot sél.PKR mimitina diidentifikasi minangka protéin antiviral ku deteksi RNA untaian ganda asing (dsRNA).Kana aktivasina, PKR phosphorylates eIF2α pikeun ngahambat sintésis protéin viral jeung sélular14,15,16.PACT (protein aktivator PKR) parantos diidentifikasi minangka protéin aktivator PKR munggaran dina henteuna dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Ngaliwatan interaksi langsung jeung PKR, PACT transduces rupa stresses (kalaparan sérum, péroxida atawa perlakuan arsenite) kana PKR jeung jalur signalling hilir.Salian fosforilasi eIF2α, aktivasina PKR-dimédiasi PACT memicu rupa-rupa kajadian anu aya hubunganana sareng réspon setrés, kalebet status rédoks anu dirobih via jalur PI3K / Akt24, mariksa karusakan DNA ditingkatkeun via p5325,26 sareng NF-κB27,28 Ngatur transkripsi, 29. Dibikeun peran kritis maranéhanana dina respon stress, proliferasi, apoptosis jeung prosés sélular konci sejen, PKR jeung PACT ngajangjikeun target terapi pikeun loba kasakit, utamana cancer30,31,32,33.Sanajan kitu, sanajan significance fungsional jeung biologis pleiotropic ieu, pangaturan aktivitas PACT / PKR dina sél kanker tetep hese dihartikeun.
lncRNAs mangrupikeun transkrip anu langkung ageung ti 200 nukléotida anu henteu aya poténsi pengkodean protéin.Kusabab proyék-proyék pangurutan génom anu canggih parantos ngaidentipikasi rébuan lncRNA, 35,36 seueur usaha anu dilakukeun pikeun ngajelaskeun fungsi biologisna.Panaliti anu ngembang parantos nunjukkeun yén lncRNA aub dina seueur prosés biologis37 kalebet régulasi inaktivasi kromosom X38,39, imprinting40, transkripsi41,42, terjemahan43 sareng bahkan pertumbuhan kanker44,45,46,47.Panaliti ieu ngalaporkeun yén seueur lncRNA anu kalibet dina jalur PACT/PKR.Hiji studi sapertos nunjukkeun yén lncRNA ASPACT ngahambat transkripsi PACT sareng ningkatkeun ingetan nuklir PACT mRNA.Panaliti séjén nunjukkeun yén lncRNA nc886 ngabeungkeut PKR sareng ngahambat fosforilasi na49,50.Sajauh ieu, lncRNA ngatur aktivasina PKR-dimédiasi PACT teu acan dilaporkeun.
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) geus diidentifikasi minangka lncRNA51,52,53,54 oncogenic.Ngaliwatan pangaturan miP-194-5p53, miP-12952 jeung miP-532-3p51, DARS-AS1 geus ditémbongkeun pikeun ngamajukeun tumuwuhna carcinoma sél renal sél jelas, carcinoma tiroid sarta carcinoma paru sél non-leutik masing-masing.Tong sareng kolega Anjeun ogé manggihan yén DARS-AS1 promotes progression myeloma ku ngajaga stabilitas protéin 39 (RBM39) motif RNA-mengikat.Nanging, henteu aya panilitian anu dilakukeun ngeunaan naha lncRNA ieu aub dina pangaturan aktivasina PACT-PKR sareng réspon setrés sél kanker.
Di dieu, urang ngalakukeun layar leungitna-of-fungsi badag skala ngagunakeun sistem CRISPRi sarta ditangtukeun yén DARS-AS1 lncRNA promotes proliferasi sababaraha jenis sél kanker.Salaku tambahan, kami parantos ngaidentifikasi mékanisme utama: DARS-AS1 langsung ngabeungkeut PACT, ngahambat PACT sareng PKR ngariung, nyegah fosforilasi eIF2α, substrat PKR anu langkung handap, sareng pamustunganana ngahambat maot sél apoptosis.Kasimpulanana, karya urang ngungkabkeun DARS-AS1 lncRNA salaku régulator jalur PACT-PKR sareng target poténsial pikeun pengobatan sareng ramalan kanker.
Studi profiling génomik éksténsif parantos ngaidentipikasi ratusan lncRNA anu aya hubunganana sareng kanker.Sanajan kitu, fungsi maranéhanana tetep umumna kanyahoan56.Pikeun ngaidentipikasi calon lncRNA ngajangjikeun aub dina progression kanker, urang ngalaksanakeun leungitna-of-fungsi layar pikeun ngurangan proliferasi dina garis sél kanker colorectal SW620 ngagunakeun sistem CRISPRi (Gbr. 1a).Fitur unik tina garis sél kanker titik SW480 sareng SW620 nyaéta aranjeunna diturunkeun tina tumor primér sareng sekundér dina hiji pasien.Ieu nyadiakeun babandingan berharga pikeun diajar parobahan genetik dina progression kanker titik maju.Ku alatan éta, urang nganalisa transcriptomes garis sél kanker colorectal (SW480 na SW620) ngagunakeun RNA sequencing sarta ngumpulkeun sababaraha lncRNAs fungsional poténsial tina literatur diterbitkeun.Dumasar kana hasil ieu, kami mendesain perpustakaan sgRNA anu ngandung 7355 sgRNA oligos nargétkeun 971 lncRNA anu aya hubunganana sareng kanker sareng 500 oligos sgRNA anu henteu disasarkeun pikeun kontrol négatip (Data Tambahan 1).
Répréséntasi skéma tina saringan ngagunakeun sistem CRISPRi.b sgRNA pengayaan sanggeus screening.Garis dotted horizontal ngagambarkeun log2 (robah melu) = ± 0,58.Garis dotted nangtung nunjukkeun nilai p = 0,05.Titik-titik hideung ngagambarkeun sgRNA non-target (ditunjuk salaku NC).Titik-titik beureum mangrupikeun sgRNA anu nargétkeun DARS-AS1.Titik biru mangrupikeun sgRNA anu nargétkeun LINC00205, lncRNA oncogenic anu dijelaskeun sateuacana.robah melu = (bacaan dinormalisasi, dinten 17) / (bacaan dinormalisasi, dinten 0).c DARS-AS1 sgRNA knockdown ngahambat pertumbuhan sél.Bar kasalahan ngagambarkeun ± simpangan baku tina tilu percobaan.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 dua-buntut murid t-test.éksprési DARS-AS1 dina tumor (dataset TCGA).Ekspresi DARS-AS1 dina sampel normal sareng tumor anu dipasangkeun ti pasien kalayan BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, sareng COAD, masing-masing (dataset TCGA).p-nilai dicandak ngagunakeun pasangan dua-buntut Student t-test.
Saatos ngawangun plasmid sareng bungkusan lentivirus, kami ngalihkeun garis sél kanker kolorektal dCas9-SW620 sareng perpustakaan di luhur dina opat percobaan inféksi mandiri.Multiplicity of infection (MOI) pikeun inféksi ieu 0.1–0.3, nunjukkeun yén unggal sél ngan bisa ditransféksi ku hiji sgRNA.Saatos 18 dinten budaya in vitro, profil pengayaan target sgRNA turun atanapi ningkat saatos saringan, sedengkeun jumlah oligonukleotida kontrol anu henteu ditargetkeun tetep teu robih dibandingkeun sareng profil pre-screening, nunjukkeun yén udagan urang ngagaduhan spésifik layar anu luhur. perpustakaan.Sangu.1b jeung tabél tambahan 1). LINC00205, nu saméméhna dilaporkeun ngamajukeun kanker paru sarta kanker ati progression58,59,60, ieu diayak kaluar (log2 (foldchange) <-0.58, p nilai <0.05), confirming reliabiliti screening ieu (Gbr. 1b). LINC00205, nu saméméhna dilaporkeun ngamajukeun kanker paru sarta kanker ati progression58,59,60, ieu diayak kaluar (log2 (foldchange) <-0.58, p nilai <0.05), confirming reliabiliti screening ieu (Gbr. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, saméméhna dilaporkeun ngamajukeun progression kanker paru sarta kanker ati58,59,60, ieu kaasup (log2 (robah melu) <-0.58, p-nilai <0.05), confirming nu kuatna screening ieu (Gbr. 1b) . Lincon205 ° 之前之前 被 报道 可 可 促进 肺癌 肺癌 肺癌 和 1,69,69 ,10, 被 值 值 值 变化 值 变化 值 值 值 值 值 值 值 (图 值 值 值 值 值 值 变化 值 变化 筛选 变化 值). Lincon205 ° 之前之前 被 报道 可 可 促进 肺癌 肺癌 肺癌 和 1,69,69 ,10, 被 值 值 值 变化 值 变化 值 值 值 值 值 值 值 (图 值 值 值 值 值 值 变化 值 变化 筛选 变化 值). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, saméméhna dilaporkeun ngamajukeun paru-paru jeung kanker ati progression58,59,60, ieu kaasup (log2 (robah melu) <-0.58, p-nilai <0.05), confirming nu kuatna screening ieu (Gbr. 1b).
Diantara sadaya lncRNA anu diuji, DARS-AS1 ogé disaring, kalayan tilu cognate sgRNA oligonucleotides nyata ngirangan saatos 18 dinten budaya, nunjukkeun yén knockdown lncRNA ieu nyababkeun panurunan proliferasi kanker (Gbr. 1b).Hasil ieu salajengna dirojong ku analisis MTS dina sél kanker colorectal némbongkeun yén laju tumuwuh sél knockdown DARS-AS1 ngan satengah dibandingkeun sél kontrol (Gambar 1c) sarta konsisten kalayan laporan saméméhna tina sababaraha jenis kanker lianna.: kanker ginjal sél jelas, kanker tiroid sarta kanker paru sél non-leutik51,52,53,55.Sanajan kitu, fungsi sarta mékanisme molekular dina kanker colorectal tetep unexplored.Ku alatan éta, urang milih lncRNA ieu pikeun ulikan salajengna.
Pikeun diajar éksprési DARS-AS1 dina pasien, urang sacara komprehensif nganalisa 10,327 sampel tumor tina proyék Cancer Genome Atlas (TCGA).Hasilna nunjukkeun yén DARS-AS1 sacara lega dikedalkeun sareng sacara signifikan ningkat dina sél séhat dina rupa-rupa tumor, kalebet adenocarcinoma titik (COAD), karsinoma sél jelas ginjal (KIRC), sareng karsinoma sél papillary ginjal (KIRP)..Saeutik pisan (Gbr. 1d jeung Gbr. Tambahan 1a, b). Analisis sampel cageur / tumor dipasangkeun salajengna dikonfirmasi éksprési nyata luhur DARS-AS1 dina tumor kandung kemih urothelial carcinoma (BLCA), ginjal renal carcinoma sél jelas (KIRC), prostat adenocarcinoma (PRAD), lung squamous cell carcinoma (LUSC) , uterine corpus endometrial carcinoma (UCEC), lung adenocarcinoma (LUAD), liver hepatocellular carcinoma (LIHC), kidney renal papillary cell carcinoma (KIRP), and colon adenocarcinoma (COAD) (p value <0.05) (Gbr. 1e-m) . Analisis sampel cageur / tumor dipasangkeun salajengna dikonfirmasi éksprési nyata luhur DARS-AS1 dina tumor kandung kemih urothelial carcinoma (BLCA), ginjal renal carcinoma sél jelas (KIRC), prostat adenocarcinoma (PRAD), lung squamous cell carcinoma (LUSC) , uterine corpus endometrial carcinoma (UCEC), lung adenocarcinoma (LUAD), liver hepatocellular carcinoma (LIHC), kidney renal papillary cell carcinoma (KIRP), and colon adenocarcinoma (COAD) (p value <0.05) (Gbr. 1e-m) .Analisis sampel cageur / tumor dipasangkeun ogé dikonfirmasi ekspresi nyata luhur DARS-AS1 dina kandung kemih urothelial carcinoma (BLCA), renal sél jelas tur carcinoma sél renal (KIRC), prostat adenocarcinoma (PRAD), lung squamous cell carcinoma (LUSC) tumor., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m). , carcinoma endometrial of the corpus uteri (UCEC), adenocarcinoma of the lung (LUAD), hepatocellular carcinoma of the liver (LIHC), papillary cell carcinoma of the kidney (KIRP), and adenocarcinoma of the colon (COAD) (nilai p < 0.05) (Gbr. 1e– m).配对 健康 / 肿瘤样本 的 分析 进步 证实 Dars-as1 1 膀胱 膀胱 膀胱 膀胱 膀胱 膀胱 尿路 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 (BLCA), 肺鳞状 细胞癌 腺腺癌 腺腺癌 透明 透明 腺腺癌 透明 透明显着 更 高高, 子宫体子宫 癌 癌 癌 (UCE), 肺腺癌 (Luad), 肝肝 肝肝 (LHHC), 肾 肾 值 细胞癌 (COD) (COD) (P 值<0,05）（图1e-m） .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌(Lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 表达 细胞癌 (Luad) 肺腺癌癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .Analisis sampel séhat / tumor dipasangkeun salajengna ngarojong peran DARS-AS1 dina kandung kemih urothelial carcinoma (BLCA), carcinoma sél renal sél jelas (KIRC), prostat adenocarcinoma (PRAD), sarta lung squamous cell carcinoma (LUSC) tumor.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). éksprési di corpus uterine carcinoma (UCEC), lung adenocarcinoma (LUAD), hepatocellular carcinoma (LIHC), renal papillary cell carcinoma (KIRP), and colon adenocarcinoma (COAD) (p value <0.05) (Gambar 1e -m).Dihijikeun, hasil ieu nunjukkeun yén DARS-AS1 sacara lega sareng dikedalkeun pisan dina rupa-rupa kanker.
Kusabab DARS-AS1 sareng DARS (gén anu ngodekeun untaian antisense) ngabagi promotor anu sami sareng ayana di gigireun masing-masing, kami ngararancang shRNA pikeun sacara khusus ngetok DARS-AS1 tapi henteu DARS (Suplemén Gbr. 2a,b sareng Tabél Tambahan 2) .Salian SW620, kami ogé ngagunakeun tilu garis sél anu sanés pisan nganyatakeun DARS-AS1 pikeun ngulik efficacy sareng pungsi knockdown shRNA (Tabel Tambahan 3).Hasil kami nunjukkeun yén sadaya tilu shRNA anu dikembangkeun ngahontal sahenteuna 80% efisiensi knockdown DARS-AS1 kalayan sakedik pangaruh kana jumlah DARS mRNA (Suplemén Gbr. 2c-f).Salaku tambahan, kami mendakan yén knockdown DARS-AS1 sareng shRNA ieu sacara signifikan ngahambat kamekaran sél dina garis sél kanker kolorektal SW620 (49.7%) sareng HCT116 (27.7%), garis sél kanker payudara MBA-MD-231 (53.4%).) jeung garis sél hepatoma HepG2 (92,7% réduksi), kitu ogé kamampuhna pikeun ngabentuk spheres unachored (rata-rata réduksi ~ 50,8%, 44,6%, 40,7% jeung 75,7% per garis sél) (Gbr. 2a, b).Dina SW620, hasil assay formasi koloni salajengna dikonfirmasi yén DARS-AS1 shRNA nyata ngahambat proliferasi sél jeung panurunan rata-rata kira 69,6% (Gbr. 2c).
Pangaruh kontrol shRNA sareng DARS-AS1 shRNA dina proliferasi sél (a) sareng formasi spheroid (b) dina sél SW620, HCT116, MBA-MD-231, sareng HepG2.c Pangaruh kontrol shRNA sareng DARS-AS1 shRNA dina formasi koloni dina sél SW620.Proliferasi sél (d), formasi spheroid (e), jeung formasi koloni (f) sél SW620 overexpressing DARS-AS1.Data anu dipidangkeun nyaéta rata-rata ± simpangan baku tina tilu percobaan.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, jeung *** p ≤ 0,001 ku dua-buntut murid t-test.
Pikeun ngalengkepan studi leungitna-of-fungsi, urang salajengna dijieun sél SW620 overexpressing DARS-AS1 (Suplemén Gbr. 2g).overexpression DARS-AS1 nyata ngaronjat pertumbuhan sél (1.8-melu), formasi spheroid unanchored (1.4-melu), sarta formasi koloni (3.3-melu) dina sél SW620 (Gbr. 2d-f).Kami mastikeun hasil ieu nganggo garis sél anu nyatakeun DARS-AS1, A549.Proliferasi sél ditingkatkeun ieu alatan overexpression DARS-AS1 salajengna dititénan dina sél A549 (Suplemén Gbr. 2h, i jeung Suplemén Table 3).Dihijikeun, studi gain sareng rugi ieu nunjukkeun yén DARS-AS1 ngamajukeun proliferasi sél kanker dina vitro.
Pikeun ngajalajah mékanisme dasar dimana DARS-AS1 ngatur proliferasi sél, kami ngalaksanakeun analisa pull-down RNA pikeun ngaidentipikasi mitra beungkeut protéin poténsial na.Hasil RT-qPCR nunjukkeun yén ngeunaan 86.2% DARS-AS1 aya dina sitoplasma sél SW620 (Suplemén Gbr. 3a).DARS-AS1 atau pseudoRNA yang ditranskripsi secara in vitro kemudian diinkubasi dengan lisat sel SW620 diikuti dengan pemisahan SDS-PAGE.Pewarnaan pérak salajengna nunjukkeun yén pita anu béda (~ 38 kDa) sacara signifikan diperkaya dina sampel tarik DARS-AS1 tapi henteu dina sampel RNA atanapi manik-manik (Gbr. 3a).Pita ieu diidentifikasi minangka protéin aktivasina PKR (PACT) ku spéktrométri massa (MS) sareng salajengna dikonfirmasi ku immunoblotting dina garis sél SW620, HCT116, sareng HepG2 (Gbr. 3a, b).Pengayaan DARS sareng protéin PACT anu aya hubunganana - PKR sareng TRBP - ogé ditalungtik nganggo analisis RNA ku Western blotting (WB).Hasilna nunjukkeun yén euweuh interaksi langsung antara DARS-AS1 RNA jeung tilu protéin ieu kapanggih (Suplemén Gbr. 3b).Interaksi spésifik antara DARS-AS1 sareng PACT salajengna dikonfirmasi ku analisis RNA immunoprecipitation (RIP), anu nunjukkeun yén DARS-AS1 sacara signifikan diperkaya dina antibodi anti PACT tapi sanés kontrol RNA anu sanés (Gambar 3c).Pikeun nangtukeun naha DARS-AS1 berinteraksi langsung sareng PACT dina henteuna komponén sélular anu sanés, uji in vitro biolayer interferometry (BLI) dilakukeun nganggo PACT dimurnikeun.Biotin-dilabélan DARS-AS1 atanapi dummy RNA ieu immobilized on streptavidin (SA) biosensors lajeng incubated dina panyangga kinétik ngandung 1 μM PACT.Utamana, PACT kabeungkeut kuat ka DARS-AS1 (nilai KD ~ 26.9 nM), tapi henteu meniru RNA (Gambar 3d).Dihijikeun, hasil ieu nunjukkeun interaksi langsung sareng pangirut anu luhur antara DARS-AS1 sareng PACT.
Analisis tarikan RNA ngaidentipikasi DARS-AS1 berinteraksi sareng PACT dina sél SW620.Luhur, ngawarnaan pérak protéin patali.Imunoblots handap dipigawé kalawan antibodi anti PACT.b RNA pull-handap analisis dipigawé dina HCT116 (luhur) jeung HepG2 (handap) sél.Pengayaan PACT dideteksi ku immunoblotting.cRNA immunoprecipitation (RIP) assays dipigawé dina sél SW620 ngagunakeun antibodi dituduhkeun.d PACT ngariung kurva ka full-panjangna DARS-AS1 atawa kontrol RNA dicandak maké biolayer interferometry (BLI).RNA diimobilisasi pada biosensor streptavidin.1 μM PACT dipaké pikeun ngukur asosiasi.e RNA pull assay ieu dipigawé maké biotinilated full-panjang DARS-AS1 atawa truncated (luhureun).Immunoblot némbongkeun PACT narima (handap).f Dimurnikeun flagged PACT ieu inkubasi ku biotinilated full-panjang DARS-AS1 atawa truncated (sakumaha dina e) pikeun in vitro RIP assay.RNA anu diekstrak diverifikasi ku RT-qPCR.g The afinitas relatif fragmén RNA béda pikeun PACT dicandak maké interferometry biolayer.Pikeun analisa, 100 nM RNA sareng 1 μM RAST dianggo.h In vitro RIP assays dipigawé maké PACT dimurnikeun gembleng atawa truncated dilabélan.RNA anu diekstrak diverifikasi ku RT-qPCR.i Laju pertumbuhan sél SW620 overexpressing DARS-AS1, PACT, atawa duanana.j Overexpression of full-length atanapi truncated DARS-AS1 dina sél SW620 miboga éfék béda dina tumuwuhna sél.k Apoptosis dideteksi ku immunoblotting kalawan antibodi anti-PARP.l Knockout of DARS-AS1 induces apoptosis sél SW620 sakumaha ditémbongkeun ku cytometry aliran.Data anu dipidangkeun nyaéta rata-rata ± simpangan baku tina tilu percobaan. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001, ku uji t Siswa dua buntut. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001, ku uji t Siswa dua buntut. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 ku uji t Siswa dua buntut. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 ku uji t Siswa dua buntut.
Kami teras ngahasilkeun tilu fragmen RNA DARS-AS1 biotinilasi ku transkripsi in vitro pikeun ngaidentipikasi daérah DARS-AS1 anu diperyogikeun pikeun asosiasi PACT (Gambar 3e).Hasil analisa RNA nunjukkeun yén unggal fragmen tiasa berinteraksi sareng PACT, tapi daérah terminal 3′ (384-768 nukléotida dilabélan A3) nunjukkeun langkung ti 1-384 nukléotida dilabélan A1) (Gbr. 3e).Hasil anu sami dititénan dina assay RIP in vitro nganggo PACT rekombinan (Gambar 3f).Konsisten jeung hasil ieu, percobaan pikeun meungkeut fragmen RNA immobilized kana PACT maké BLI ogé némbongkeun yén PACT boga pangirut luhur pikeun A3 (384-768 nt) (nilai KD kurang leuwih 94.6 nM), bari ampir euweuh link jeung wewengkon séjén.(Gbr. 3d).
Urang ogé nalungtik wewengkon mengikat pakait dina PACT.PACT ngandung tilu domain fungsional, dua di antarana conserved dobel-stranded RNA-binding domain (dsRBD) jeung domain katilu (ditunjuk D3) nu tindakan minangka hiji aktivator interaksi protéin.Pikeun nguji kapasitas beungkeutan lncRNA unggal domain, kami direkayasa tilu mutasi anu ngaleungitkeun unggal tilu domain sareng ngalaksanakeun assay RIP in vitro.Hasilna nunjukkeun yén ngahapus domain katilu (D3) PACT sacara signifikan ngirangan interaksina sareng DARS-AS1 (ku 0.11-melu dibandingkeun sareng PACT anu utuh) dibandingkeun sareng dua mutasi anu sanés (Gbr. 3h), éta nunjukkeun yén sékrési éta. tina D3 berinteraksi sareng DARS.-AC1.Dihijikeun, hasil ieu nunjukkeun yén interaksi antara DARS-AS1 sareng PACT tiasa lumangsung utamina ngaliwatan tungtung 3' DARS-AS1 sareng domain D3 PACT.
Urang dicatet yén DARS-AS1 teu boga pangaruh kana éksprési PACT na PACT teu boga pangaruh dina DARS-AS1 (Suplemén Gbr. 3c).Urang teras nalungtik pangaruh PACT knockdown dina kamekaran sél.Kontras jeung DARS-AS1, sél relatif tumuwuh 1.5-3 kali leuwih gancang nalika PACT ieu knocked handap (Suplemén Gbr. 3d).Hasil tina assay formasi koloni nunjukkeun yén sél ngawangun koloni 2-3-melu sanggeus perlakuan shRNA kalawan PACT (Suplemén Gbr. 3e).Pikeun nguji naha DARS-AS1 ngatur proliferasi sél ngaliwatan PACT, kami ngahasilkeun sél SW620 overexpressing PACT, DARS-AS1, atawa duanana.Overexpression PACT nunjukkeun inhibisi signifikan tina proliferasi sél (Gambar 3i).Nalika overexpression DARS-AS1 per se sacara signifikan ngamajukeun proliferasi sél, teu aya bédana anu signifikan dina laju pertumbuhan sél anu overexpressing DARS-AS1 sareng PACT.Hasil ieu nunjukkeun yén PACT tiasa ngalawan paningkatan proliferasi disababkeun ku overexpression DARS-AS1.
Kusabab daérah anu béda-béda DARS-AS1 gaduh kamampuan beungkeutan PACT anu béda, kami nalungtik pangaruh relatifna dina proliferasi sél ku éksprési anu béda tina fragmen DARS-AS1.Dibandingkeun jeung dua fragmen sejen, DARS-AS1 ieu overexpressed dina 3' tungtung (384-768 nt), wewengkon PACT-patali utama dina DARS-AS1, nu miboga kamampuh pangluhurna pikeun merangsang proliferasi sél (Gbr. 3j).Hasil ieu nunjukkeun korelasi positif antara kapasitas ngariung jeung fungsi biologis DARS-AS1.
PACT parantos dilaporkeun janten protéin pro-apoptosis19.Kituna, urang nalungtik pangaruh DARS-AS1 on apoptosis.Saperti nu diharapkeun, knockdown DARS-AS1 nyata ngaronjat belahan PARP dina sél SW620 jeung ngaronjat proporsi annexin sél V-positip dina SW620, HCT116, HepG2, sarta garis sél ambÃ-MD-231 (Gbr. 3k).3).3f-h), nunjukkeun yén pangaruh anti-apoptosis DARS-AS1 dina sél kanker sabalikna tina fungsi apoptosis-inducing PACT.Dihijikeun, hasil ieu nunjukkeun yén mékanisme fungsi onkogenik DARS-AS1 tiasa ngalangkungan inhibisi fungsi PACT.
Salajengna, urang ngajajah implikasi fungsional tina asosiasi DARS-AS1-PACT.PACT parantos dilaporkeun ngaktifkeun PKR ngaliwatan interaksi langsung, anu salajengna ningkatkeun fosforilasi eIF2α, nyababkeun penghapusan translasi sareng apoptosis17.Mimiti, urang nalungtik naha DARS-AS1 mangaruhan lokalisasi sélular PACT sareng PKR.Mikroskopi fluoresensi confocal nunjukkeun yén PACT sareng PKR dikolokalisasi pisan dina sél SW620 kalayan koéfisién korelasi Pearson rata-rata 0.72.Samentara éta, overexpression DARS-AS1 sacara signifikan ngirangan PACT sareng PKR ko-lokalisasi (hartosna koefisien korelasi Pearson 0.61) (Gambar 4a).Pikeun nalungtik naha DARS-AS1 tiasa ngamodulasi interaksi PACT-PKR, kami ngalaksanakeun assay co-immunoprecipitation (co-IP) sareng antibodi anti PACT dina lysates sél SW620.PKR ieu kacida enriched di anti Pakta dina sél kontrol, bari recovery PKR ieu nyata ngurangan di lysates ti sél overexpressing DARS-AS1 (Gbr. 4b).Dimurnikeun dilabélan PACT na PKR dipaké pikeun in vitro protéin assays mengikat.Sasuai, anu nyayogikeun DARS-AS1 tapi henteu aya RNA kontrol nunjukkeun interaksi PACT-PKR anu diteken (Gambar 4c).Sadaya hasil nunjukkeun yén DARS-AS1 ngaganggu komunikasi PACT sareng PKR.
a Co-lokalisasi PACT sareng PKR dina sél kontrol atanapi sél overexpressing DARS-AS1 dititénan nganggo mikroskop fluoresensi confocal.Inti diwarnaan ku DAPI.Hasil statistik dicandak tina 16 poto.b Co-immunoprecipitation (co-IP) ngagunakeun antibodi anti PACT dina lysates sél kontrol sél SW620 atawa sél overexpressing DARS-AS1.c Dilabélan PACT, PKR dimurnikeun jeung ditranskripsi in vitro kalawan DARS-AS1 atawa RNA bohongan diinkubasi pikeun analisis beungkeutan protéin in vitro.Antibodi anti bandéra dipaké pikeun immunoprecipitation.d Immunoblots kalawan antibodi dituduhkeun anu dipigawé dina sél SW620 na HCT116 transfected kalawan kontrol shRNA atanapi DARS-AS1-shRNA dituturkeun ku kalaparan sérum.e tingkat ekspresi DARS-AS1 dirobah sensitipitas sélular kana thapsigargin.Sél SW620 ditransféksi ku DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 overexpression plasmid atanapi kontrol plasmid.Sél dirawat kalayan thapsigargin salami 48 jam sareng viability sél ditangtukeun nganggo réagen MTS.f In vitro ditranskripsi DARS-AS1 atanapi dummy RNA sareng PACT dimurnikeun dianggo pikeun assay aktivasina in vitro sareng deteksi immunoblot.g Immunoblots maké antibodi ieu dipigawé dina sél SW620-ctrl (kénca) atawa sél overexpressing PKR mutants (katuhu).Sél ieu lajeng transfected kalawan kontrol shRNA atanapi DARS-AS1-shRNA dituturkeun ku kalaparan sérum.h Aliran cytometry némbongkeun yén inactivation tina PKR mutant ngimbangan apoptosis DARS-AS1-ngainduksi dina sél SW620.i Immunoblots kalawan antibodi dituduhkeun dipigawé dina SW620 (kénca) atawa HCT116 (katuhu) sél.Sél anu ditransféksi ku kontrol shRNA atanapi DARS-AS1 shRNA dicabut sérum sareng ditambah ku 100 nM PKR C16 inhibitor atanapi DMSO.Skala bar = 5 µm.Data anu dipidangkeun nyaéta rata-rata ± simpangan baku tina tilu percobaan.* p ≤ 0,05 dua-buntut murid t-test.
Umumna dipercaya yén sakali PACT berinteraksi sareng PKR17, fosforilasi PKR dina Thr451 tiasa ngainduksi.Hasilna kami nunjukkeun yén tingkat fosforilasi PKR sacara signifikan ningkat dina sél knockdown DARS-AS1 saatos kalaparan sérum (Gbr. 4d sareng Gambar Tambahan 4a).Sasuai, kami mendakan yén fosforilasi eIF2α, substrat PKR utama, ogé ningkat sacara signifikan ku DARS-AS1 shRNA (Gbr. 4d sareng Gambar Tambahan 4a).Thapsigargin mangrupa stressor ER nu ngabalukarkeun ER ngaleupaskeun Ca2 +.Perlakuan jeung thapsigargin geus dilaporkeun ka induksi éksprési jeung aktivasina PACT, nu salajengna berinteraksi sareng tur ngaktifkeun PKR, anjog ka apoptosis ku ngaronjatna eIF2α fosforilasi 18,61.Di dieu, kami nganggo thapsigargin salaku stimulator jalur PACT / PKR pikeun nalungtik naha DARS-AS1 tiasa ngabantosan sél pikeun ngatasi setrés ku ngahambat jalur PACT / PKR.Kami niténan yén tingkat ekspresi DARS-AS1 sacara positif pakait sareng résistansi sél ka thapsigargin.Sél SW620 overexpressing DARS-AS1 salamet hadé lamun dirawat kalayan thapsigargin, sedengkeun sél kalawan knockdown DARS-AS1 janten langkung rentan (Gbr. 4e).Konsisten jeung hasil ieu, DARS-AS1 overexpression ngurangan thapsigargin-ngainduksi PKR fosforilasi (Suplemén Gbr. 4b).Kontras, sanggeus perlakuan thapsigargin, PKR na eIF2α anu phosphorylated ka extent luhur dina sél knockdown DARS-AS1 dibandingkeun sél kontrol (Suplemén Gbr. 4b).Narikna, thapsigargin ngainduksi éksprési DARS-AS1 dina cara anu gumantung kana dosis, anu tiasa nunjukkeun fungsi anti setrés DARS-AS1 (Suplemén Gbr. 4c).Salaku tambahan, kami ngalaksanakeun tés aktivasina in vitro pikeun mastikeun observasi ieu.Sakeudeung, PKR dimurnikeun tina lisat sél nganggo antibodi anti PKR, teras diinkubasi ku PACT rekombinan sareng DARS-AS1 ditranskripsi sacara in vitro.Saatos réaksi énzimatik, fosfo-PKR dideteksi nganggo WB.Hasil kami nunjukkeun yén fosforilasi PKR sacara signifikan dihambat ku DARS-AS1, tapi henteu ku kontrol RNA (Gambar 4f).Hasil in vitro sareng in vivo ieu nunjukkeun yén DARS-AS1 ngahambat aktivasina PKR anu dimédiasi PACT.Dina waktos anu sami, urang ogé ningali panurunan dina pamulihan PACT ku ayana DARS-AS1 (Gambar 4f).Hasilna konsisten sareng hasil tina assay beungkeutan protéin in vitro (Gambar 4c) sareng deui ngagambarkeun fungsi blocking DARS-AS1 pikeun asosiasi PACT-PKR.
Ser246 sareng Ser287 dina domain D3 PACT diperyogikeun pikeun aktivasina PKR dina kaayaan setrés sélular.Substitusi dua résidu serine pikeun alanin masihan mutant PACT (mutD), anu ngaktifkeun PKR dina henteuna setrés, sareng substitusi alanin (mutA) ngabalikeun protokol.Kusabab kami parantos nunjukkeun pentingna domain ieu dina hubungan langsung sareng DARS-AS1, kami ngahasilkeun dua mutan PACT ieu pikeun nguji naha résidu ieu ogé tiasa kalibet dina interaksi sareng DARS-AS1.Narikna, duanana mutants leungit kamampuhan pikeun ngabeungkeut DARS-AS1 (Suplemén Gbr. 4d), suggesting yén struktur lengkep protéin PACT bisa jadi diperlukeun pikeun interaksi efisien jeung DARS-AS1.
Saterusna, hasil urang ogé nyarankeun yén DARS-AS1-shRNA-ngainduksi inhibisi proliferasi sél bisa sawaréh dibalikeun ku overexpressing a dominan PACT mutant négatip (PACTmutA) atawa dominan négatip PKR mutant (PKRmut) (Suplemén Gbr. 4e. e).Overexpression mutan PKR dominan-négatip ngurangan fosforilasi PKR ngainduksi ku knockdown DARS-AS1 ogé fosforilasi eIF2α dina sél sérum-deprived (Gbr. 4g).Langkung importantly, proporsi sél apoptosis ngainduksi ku knockdown DARS-AS1 ogé diréduksi dina sél overexpressing PKRmut (Gbr. 4h jeung Suplemén Gbr. 4g).Inhibisi aktivitas kinase PKR ogé impairs fungsi DARS-AS1, sakumaha hasil némbongkeun yén knockdown DARS-AS1 jarang dipicu PKR na eIF2α fosforilasi nalika sél dirawat ku inhibitor C16 PKR-spésifik (Gbr. 4i jeung Tambahan Gbr. 4h).).Dihijikeun, hasil kami nunjukkeun yén DARS-AS1 ngamajukeun proliferasi sél, sahenteuna sabagian, ku ngahambat aktivasina PKR-dimédiasi PACT.
Pikeun langkung ngajalajah peran DARS-AS1 dina tumorigenesis, kami ngalaksanakeun percobaan vivo nganggo modél xenograft beurit. Hasilna nunjukkeun yén knockdown DARS-AS1 sacara dramatis ngirangan pertumbuhan tumor dina mencit (nilai p <0.0001) (Gbr. 5a). Hasilna nunjukkeun yén knockdown DARS-AS1 sacara dramatis ngirangan pertumbuhan tumor dina mencit (nilai p <0.0001) (Gbr. 5a). Результати показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0.0001) (c. 5а). Hasilna nunjukkeun yén knockdown DARS-AS1 sacara drastis ngirangan pertumbuhan tumor dina mencit (nilai p <0.0001) (Gambar 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）.结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）. Результати показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0.0001) (c. 5а). Hasilna nunjukkeun yén knockdown DARS-AS1 sacara signifikan ngirangan pertumbuhan tumor dina mencit (nilai p <0.0001) (Gambar 5a).Janten, dina grup knockdown DARS-AS1, aya panurunan anu signifikan dina volume tumor rata-rata sakitar 72.9% sareng rata-rata massa tumor sakitar 87.8% (Gambar 5b-d).Hasil ieu nunjukkeun yén DARS-AS1 sacara signifikan tiasa ngamajukeun kamekaran tumor dina vivo.
Balukar tina iklan DARS-AS1 knockdown on oncogenesis colorectal dina mencit buligir.Kurva pertumbuhan (a), ukuran tumor (b), beurat (c), jeung gambar tumor (d) ditémbongkeun.Bar kasalahan ngagambarkeun ± SEM. n = 10. ****p <0,0001, ku uji t Murid dua buntut. n = 10. ****p <0,0001, ku uji t Murid dua buntut. n = 10. ****p < 0.0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 dua-buntut murid t-test.n = 10. ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0.0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 dua-buntut murid t-test.e Kaplan-Meier dianalisis korelasi antara tingkat ekspresi DARS-AS1 jeung survival sakabéh di penderita UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, sarta LGG.tingkat luhur ekspresi DARS-AS1 di penderita éta di luhur 50%;tingkat low ekspresi DARS-AS1 di penderita éta di handap 50%.p-nilai ditangtukeun ngagunakeun uji log rank.f Modél anu diusulkeun dimana DARS-AS1 ngatur jalur PACT-PKR sareng kamekaran tumor.
Pikeun leuwih hadé ngartos dampak klinis DARS-AS1, urang nalungtik korelasi antara ekspresi sarta survival sabar.Ku analisa dataset TCGA, urang manggihan yén ekspresi DARS-AS1 luhur ieu pakait sareng uveal melanoma (UVM), renal chromophobia (KICH), renal papillary carcinoma sél (KIRP), mesothelioma (MESO), multiplex.Survival handap sacara signifikan pakait sareng morfosis glioblastoma (GBM) sareng pasien kalayan glioma otak kelas rendah (LGG) (Gambar 5e).Hasil ieu nunjukkeun yén DARS-AS1 tiasa maénkeun peran penting dina kamajuan tumor klinis sareng tiasa janten biomarker duga poténsial dina sababaraha kanker.
Dina ulikan ieu, ngagunakeun saringan fungsional CRISPRi skala ageung, urang nangtukeun yén DARS-AS1 lncRNA ngatasi setrés sél kanker ku ngatur dua réspon setrés konci, PACT sareng PKR.Ku interaksi langsung sareng PACT, DARS-AS1 ngahambat aktivasina PKR anu dimédiasi PACT, ku kituna nyegah maot sél apoptosis sareng ngamajukeun proliferasi sél (Gbr. 5f).Upregulasi DARS-AS1 parantos dititénan dina sababaraha jinis kanker, nunjukkeun yén fungsina pikeun ngamajukeun kasalametan sél kanker dina kaayaan stres tiasa sacara lega tiasa dianggo pikeun sababaraha jinis kanker.
PACT parantos diidentifikasi minangka protéin aktivator PKR, sareng aktivasina PKR anu dimédiasi PACT maénkeun peran anu penting dina réspon setrés ku ngatur transkripsi, tarjamahan, apoptosis, sareng prosés sélular anu penting62.Mangtaun-taun, usaha parantos dilakukeun pikeun ngartos aturan khusus kanker tina kaskade PACT-PKR.Di dieu, ulikan kami ngungkabkeun mékanisme pangaturan PACT-PKR anu béda dina sél kanker ngalangkungan lncRNA DARS-AS1 sélular, anu langsung ngabeungkeut PACT, ngahalangan interaksi PACT-PKR, ngahambat aktivasina PKR sareng fosforilasi eIF2α, ku kituna ngahambat apoptosis anu disababkeun ku setrés. merangsang proliferasi kanker ahirna.sél.Penemuan ieu ngajelaskeun poténsi target lncRNA pikeun prognosis sareng terapi kanker.
Data kami nunjukkeun yén knockdown DARS-AS1 ngasensitipkeun sél kana kalaparan sérum kalayan paningkatan anu signifikan dina PKR fosforilasi sareng eIF2α.Hasil ieu nunjukkeun yén DARS-AS1 ngamajukeun kasalametan sél kanker dina kaayaan anu parah ku ngahambat kagiatan PACT / PKR.Sababaraha RNA non-coding anu sanés, sapertos ASPACT sareng nc886, ogé kalibet dina sumbu PACT/PKR ku cara ngarégulasi mRNA PACT48 atanapi ngatur autofosforilasi ku cara ngabeungkeut PKR49,50,64.Di antarana, DARS-AS1 tindakan minangka disruptor tina PACT-PKR pakaitna.Panaliti ieu ningkatkeun pamahaman kami ngeunaan pangaturan sumbu PACT / PKR sareng peran lncRNA dina réspon setrés.
PACT ngandung tilu domain anu misah.Masing-masing tina dua dsRBD anu munggaran cekap pikeun ngahontal beungkeutan PACT anu luhur ka PKR, sedengkeun domain katilu (D3) diperyogikeun pikeun aktivasina PKR in vitro sareng in vivo.Ulikan urang némbongkeun yén DARS-AS1 preferentially interaksi jeung domain D3 (Gbr. 3h).Kusabab ukuran lncRNA anu ageung (768 nukléotida), DARS-AS1 ngabeungkeut D3 sacara fisik tiasa ngahambat interaksi antara domain PACT dsRBD sareng PKR, ku kituna ngahalangan asosiasi PACT sareng PKR.Mutasi titik PACT anu ngagentos Ser246 sareng Ser287 dina D3 sareng alanin atanapi aspartat ngaganggu afinitas anu ngariung pikeun DARS-AS1, nunjukkeun pentingna sipat struktural sareng listrik D3 sacara umum dina asosiasina.Rincian langkung seueur ngeunaan mékanisme ieu bakal diperyogikeun di hareup, nganggo analisis biokimia anu langkung tepat sareng analisis struktur PACT resolusi luhur.
Studi saméméhna geus ngalaporkeun yén DARS-AS1 promotes proliferasi sél ngaliwatan sababaraha mékanisme51,52,53.Dina hiji conto, panalungtik niténan yén DARS-AS1 upregulated na antisense protéin-encoding gén DARS ku targeting miP-194-5p dina sél kanker ginjal.Nanging, dina pangajaran ayeuna, knockdown DARS-AS1 ngagaduhan sakedik pangaruh kana transkripsi DARS dina sababaraha jinis kanker, kalebet sahenteuna kanker kolorektal, payudara, sareng ati.Kusabab lncRNAs némbongkeun pola éksprési sél- jeung jaringan-spésifik, mékanisme fungsional bisa jadi teu dilestarikan sakuliah jenis kanker, nu bisa nyumbang kana bédana ieu antara observasi urang jeung assessments saméméhna tina kangker béda.Panaliti khusus diperyogikeun pikeun ngajelaskeun mékanisme khusus tina sababaraha prosés fisiologis sareng patologis.
Analisis data klinis nunjukkeun yén éksprési DARS-AS1 dina tumor dihubungkeun tibalik sareng kasalametan pasien kanker, anu negeskeun pentingna sumbu DARS-AS1 / PACT / PKR dina prognosis kanker.Dina kacindekan, panilitian kami nunjukkeun yén DARS-AS1 mangrupikeun régulator sumbu sinyal PACT / PKR, ngamajukeun proliferasi sél kanker, sareng ngahambat apoptosis salami réspon setrés, anu nyayogikeun jalur panalitian sanés sareng dipikaresep pikeun panalungtikan kahareup kana pangobatan poténsial. .
Garis sél manusa SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 sareng HEK293T dicandak tina Infrastruktur Sumber Daya Jalur Sel Nasional di Cina.Sadaya sél dijaga dina medium DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) ditambah ku 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) sareng 1% pénisilin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) dina 37 ° C, 5% CO2.inkubator.
Anti PACT, Abcam (ab31967);Anti PKR, Abcam (ab184257);Anti PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti Bandéra, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (fosfor S51), Abcam (ab32157);anti PACT (fosfor S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulin, CST (2128);beurit normal IgG, CST (5415S);kelenci normal IgG, CST (2729S).Antibodi diluted 1:1000 di PBST pikeun Western blotting jeung 1:100 pikeun IP.
sgRNA dikembangkeun nganggo alat anu sayogi umum anu disebut CRISPR-ERA66.Kami nganggo parameter alat standar pikeun pamekaran sgRNA sareng algoritma ngitung situs beungkeutan sgRNA di daérah 3 kb.dipuseurkeun di TSS.Pools of sgRNA oligonucleotides anu disintésis di CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) sarta diklon kana plasmid pgRNA humanized (Addgene #44248).Jumlahna aya 12 µg plasmid pgRNA humanized pooled, 7.2 µg psPAX2 (Addgene #12260), sareng 4.8 µg pMD2.G (Addgene #12259) ditransfeksikeun kana 5 x 106 HEK293T dishes nganggo Regent DNA 106 Transfection dina 10. sél (CWBIO, Beijing, Cina) nuturkeun parentah produsén urang.Supernatan anu ngandung virus dikumpulkeun 48 sareng 72 jam saatos transfeksi sareng disaring ngaliwatan saringan 0,45 µm.Pikeun screening, sél SW620 nganyatakeun protéin fusi dCas9 / KRAB dicandak ku transduksi virus.Sél SW620 anu dirobih katépaan ku perpustakaan virus dina opat percobaan inféksi mandiri dina MOI 0.1-0.3 sareng disampel ku puromycin 2 μg / ml (Sigma, St. Louis, MO) salami 2 dinten.Saatos éta, sél dikultur salami 18 dinten in vitro kalayan cakupan perpustakaan minimum 500 sél / sgRNA pikeun saringan.
DNA génomik diekstrak dumasar kana paréntah tina Kit Midi Darah DNA QIAamp (QIAGEN, Düsseldorf, Jérman; 51183).Dina total, 100 μg DNA génomik per ulangan biologis dipaké pikeun ngawangun perpustakaan.Wewengkon sgRNA diamplifikasi ku dua putaran PCR sareng dihubungkeun sareng barkod.
Produk PCR dimurnikeun nganggo gél NucleoSpin® sareng kit purifikasi PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, Jérman; 740609.250) sareng dikuantifikasi nganggo kit deteksi DNA untaian ganda Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Uji MTS digunakeun pikeun ngukur proliferasi sél.Sél dibibita dina piring 96-sumur dina kapadetan awal 2000 sél / sumur.Jumlah rélatif sél diukur unggal dinten dina waktos anu dituduhkeun jumlahna 4-6 dinten.Pikeun unggal sumur, 20 μl réagen MTS (Promega) éncér sareng 100 μl DMEM, diinkubasi sareng sél salami 4 jam dina suhu 37 ° C, teras OD490 diukur.
Kapasitas pikeun pertumbuhan anu teu kabeungkeut kapanggih ku nganalisa formasi spheres.Sakeudeung, 2000 sél transfected kalawan shRNA DARS-AS1 atawa kontrol shRNA anu berbudaya dina microplates kantétan ultra low (Corning) kalayan robah sedeng unggal 4 poé.Spheroids diitung sanggeus 14 poé.Sél 500 anu ditransféksi ku plasmid overexpression DARS-AS1 atanapi plasmid kontrol dianggo pikeun assay paningkatan, upami metodena henteu robih.
RNA ditranskripsi maké T7 RNA polymerase jeung biotin-16-UTP (Roche 1138908910) nurutkeun parentah Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Primer anu digunakeun di dieu dibéréndélkeun dina Tabél Tambahan 4.
Protéin-coding PACT atanapi PKR daérah dikloning kana pET15b (Addgene #73619) sareng dirobih janten BL21 (DE3).Baktéri diinkubasi sapeuting dina LB anu disayogikeun sareng ampicillin teras éncér 100 kali lipat sareng LB seger.Nalika OD600 tina médium ngahontal 0,8, 1 mM IPTG ditambahkeun pikeun ngainduksi éksprési protéin.Saatos inkubasi sapeuting kalayan oyag lembut (250 rpm dina 20 ° C), pellet sél dikumpulkeun ku sentrifugasi (4000 rpm, 10 mnt, 4 ° C).Resuspend pellet sél dina lysis panyangga (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) jeung incubate dina és pikeun 30 mnt, lajeng sonicate (15 mnt, 5 s on / off, dina és) jeung centrifuge (13.000). rpm)., 30 mnt, 4°C).Supernatan ieu lajeng dimuat kana résin Ni-NTA (QIAGEN) 3 kali dina 4 ° C, dikumbah 4 kali kalayan nyeuseuh panyangga (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidazole, 250 mM NaCl) jeung eluted 3 kali, kalawan total. tina 10 ml eluent panyangga (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazole).Protéin dimurnikeun ditangtukeun maké WB jeung konsentrasi ditangtukeun maké Qubit ™ kit assay protéin (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
RIP assays dipigawé sakumaha ditétélakeun saméméhna, kalawan modifikasi.Sakeudeung, 1x RIP panyangga (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotéhnologi), 1 mM DDM, protease) lyses cytostatic 1 x 1077 cocktail. (Roche, 1 mM DTT) jeung centrifuge dina 13.000 rpm salila 15 mnt dina 4 °C.Supernatan ieu lajeng diinkubasi ku protéin A + G manik magnét (Millipore) conjugated kalawan 5 μg antibodi anti PACT (Abeam) atawa IgG (CST).Manik-manik dikumbah 5 kali nganggo panyangga RIP 5x, teras dicerna nganggo protéinase K (NEB).RNA diekstrak nganggo Trizol sareng ditangtukeun ku RT-qPCR.Primer dibere dina Table Tambahan 5.
Uji RIP in vitro dilaksanakeun dumasar kana protokol uji RIP standar anu dirobih.Jumlahna aya 5 pmol RNA anu ditranskripsi in vitro diencerkeun 1x sareng panyangga RIP sareng dianil ku inkubasi dina suhu 65 ° C salami 5 menit dituturkeun ku pendinginan anu laun dugi ka suhu kamar.Jumlahna aya 5 pmol protéin PACT utuh atanapi mutated flag-dilabélan dimurnikeun tina E. coli.Inkubasi sareng RNA anu direnatur salami 2 jam dina suhu 4 ° C sareng turutan prosedur di luhur pikeun analisis RIP pikeun IP anti-bandéra.
Pikeun analisa ekstensi RNA, sél 1 × 107 dilisiskeun ku panyangga 1xRIP.Saatos sentrifugasi dina 13.000 rpm salami 15 mnt dina suhu 4 ° C, supernatan parantos dirawat kalayan 30 μl manik magnét streptavidin (Beckman) salami 2 jam dina suhu 4 ° C.Lysate dimurnikeun ieu lajeng disadiakeun kalawan ragi tRNA jeung incubated kalawan 40 pmol RNA renatured sapeuting dina 4 ° C, lajeng pikeun 2 jam sejen tur 20 μl streptavidin manik magnét anyar diblokir ku BSA ditambahkeun.Léngkah cuci diwangun ku 4 kali kalayan panyangga 5x RIP sareng 4 kali kalayan panyangga RIP 1x.Protéin anu saluyu diélusi ku panyangga élusi biotin (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) sareng dipisahkeun dina NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gél (Invitrogen).Saatos ngawarnaan pérak (Biotéhnologi Beyotime), pita-pita anu tangtu dipotong sareng dianalisis ku MS.
Analisis Co-IP dilakukeun pikeun nguji interaksi antara PACT sareng PKR.Sakeudeung, lysates supernatant disiapkeun ku incubating 1 x 107 sél lysed dina 1 x RIP panyangga dituturkeun ku centrifugation dina 13.000 rpm salila 15 menit dina 4 ° C.Lysates dieusian ku protéin A + G manik magnét, conjugated kalawan 5 µg antibodi anti PACT, sarta gently diputer sapeuting dina 4 ° C.Manik dikumbah 3 kali nganggo panyangga 5 × RIP, dua kali kalayan panyangga 1 × RIP sareng dielusi ku panyangga 1 × SDS.Protéin anu pulih dianalisis ku gél SDS-PAGE sareng dideteksi ku WB.
Dua pmol PACT flagged sareng 1 pmol PKR dimurnikeun tina E. coli.Éncér dina panyangga 1× RIP sareng inkubasi sareng 10 pmol RNA anu dirénatur salami 2 jam dina suhu 4 °C.Saatos éta, aranjeunna diinkubasi ku protéin A + G magnét bead-conjugated anti-dilabélan antibodi pikeun tambahan dua jam.Manik-manik teras dikumbah opat kali nganggo panyangga RIP 1x sareng dielusi ku panyangga 1x SDS.PACT sareng PKR anu hasilna dideteksi ku WB.