Warta

Hatur nuhun pikeun ngadatangan Nature.com.Versi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan CSS kawates.Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun yén anjeun nganggo browser anu diropéa (atanapi nganonaktipkeun Mode Kasaluyuan dina Internet Explorer).Samentawis waktos, pikeun mastikeun dukungan anu terus-terusan, kami bakal ngajantenkeun situs tanpa gaya sareng JavaScript.
Métode panyiri jarak énzimatik dumasar kana éster diaktipkeun atanapi radikal fénoksi seueur dianggo pikeun memetakan protéom subsélular sareng interaksi protéin dina sél hirup.Tapi, éster anu diaktipkeun kurang réaktif, hasilna radius panyiri anu lega, sareng radikal fénoksi anu dihasilkeun ku perlakuan péroxida tiasa ngaganggu jalur rédoks.Di dieu kami ngalaporkeun metode fotoaktivasi gumantungna labél jarak (PDPL) anu dikembangkeun ku ngaitkeun sacara genetik protéin miniSOG photosensitizer kana protéin anu dipikaresep.Dipicu ku lampu biru jeung dikawasa ku waktu paparan, oksigén singlet dihasilkeun lajeng spatiotemporally ngumbar panyiri résidu histidine ku usik aniline kahontal.Kami nunjukkeun kasatiaan anu luhur ngaliwatan pemetaan proteome khusus organél.Perbandingan sisi-demi-sisi PDPL sareng TurboID nunjukkeun sinyalna proteomik anu langkung spésifik sareng komprehensif ngeunaan PDPL.Salajengna, urang dilarapkeun PDPL kana kasakit-pakait transcriptional coactivator BRD4 na E3 Parkin ligase sarta kapanggih interactors saméméhna kanyahoan.Ku saringan overexpression, dua substrat anu teu dipikanyaho, Ssu72 sareng SNW1, diidentifikasi pikeun Parkin, anu degradasina dimédiasi ku jalur ubiquitination-proteasome.
Karakterisasi jaringan protéin anu akurat ngadasarkeun seueur prosés sélulér dasar.Ku alatan éta, pemetaan spasiotemporal kacida akurat interaksi protéin bakal nyadiakeun dasar molekular pikeun deciphering jalur biologis, Patologi kasakit, sarta disrupting interaksi ieu keur kaperluan terapi.Pikeun tujuan ieu, metode anu tiasa ngadeteksi interaksi temporal dina sél atanapi jaringan hirup anu dipikahoyong pisan.Affinity Purification Mass Spectrometry (AP-MS) parantos dianggo pikeun ngaidentipikasi mitra beungkeut protéin anu dipikaresep (POI).Kalayan pamekaran metode proteomik kuantitatif, Bioplex3.0 diciptakeun, pangkalan data jaringan protéin panggedéna dumasar kana AP-MS.Sanaos AP-MS kuat pisan, lisis sél sareng léngkah éncér dina alur kerja condong kana interaksi beungkeutan anu lemah sareng fana sareng ngenalkeun artefak pasca-lisis sapertos pasangan interaksi palsu anu kakurangan komparteménalisasi sateuacan lisis.
Pikeun ngatasi masalah ieu, asam amino teu alami (UAA) sareng gugus panyambung silang sareng platform labél caket dieu énzimatik (PL) (contona APEX sareng BioID)5 parantos dikembangkeun.Sanaos metodeu UAA parantos suksés diterapkeun dina seueur skénario sareng nyayogikeun inpormasi ngeunaan napel protéin langsung, optimasi situs sisipan UAA masih diperyogikeun.Anu langkung penting, éta mangrupikeun metode panyiri stoichiometric anu henteu ngabalikeun katalitik tina acara panyiri.Sabalikna, métode PL énzimatik, saperti métode BioID, ngahijikeun ligase biotin anu direkayasa jadi POI7, anu saterusna ngaktifkeun biotin pikeun ngabentuk perantara éster biotinil-AMP réaktif.Énzim sahingga ngatalisan sareng ngaleupaskeun "awan" biotin anu diaktipkeun anu ngalabélan résidu lisin proksimal.Sanajan kitu, BioID merlukeun leuwih ti 12 jam pikeun ménta sinyal dilabélan cukup, nu precludes pamakéan na kalawan resolusi temporal.Ngagunakeun évolusi diarahkeun dumasar kana tampilan ragi, TurboID dirancang dumasar kana BioID jadi leuwih efisien, sahingga labél efisien jeung biotin dina 10 menit, sahingga prosés leuwih dinamis bisa ditalungtik.Kusabab TurboID aktip pisan sareng tingkat biotin endogen cekap pikeun panyiri tingkat rendah, panyiri latar janten masalah poténsial nalika panyiri anu ditingkatkeun sareng waktosna diperyogikeun ku tambihan biotin eksogen.Sajaba ti éta, éster diaktipkeun kirang réaktif (t1/2 ~ 5 mnt), nu bisa ngakibatkeun radius panyiri badag, utamana sanggeus jenuh protéin tatangga jeung biotin 5. Dina pendekatan sejen, fusi genetik direkayasa ascorbate peroksidase (ie biotin- radikal fénol sarta ngidinan panyiri protéin dina hiji menit9,10 APEX loba dipaké pikeun ngaidentipikasi proteomes subsélular, kompléx protéin mémbran, sarta kompléx protéin signalling cytosolic11, 12. Tapi, kabutuhan konsentrasi luhur péroxida bisa mangaruhan protéin rédoks atawa jalur, disrupting prosés sélular.
Ku kituna, métode anyar nu bisa ngahasilkeun leuwih réaktif dilabélan-radius spésiés suprési kalawan akurasi spasial tur temporal tinggi tanpa nyata disrupting jalur sélular bakal tambahan penting pikeun métode nu aya. Di antara spésiés réaktif, oksigén singlet ngahudangkeun perhatian urang kusabab umurna pondok sareng radius difusi kawates (t1/2 <0.6 µs dina sél)13. Di antara spésiés réaktif, oksigén singlet ngahudangkeun perhatian urang kusabab umurna pondok sareng radius difusi kawates (t1/2 <0.6 µs dina sél)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограгници и ограгници и ограгници и граслород излород из-за его короткого времени жизни и ограгнича и ограгничают, 1 мердиного времени и ограгниче/2х, 6 глодного Diantara bentuk aktif, oksigén singlet narik perhatian urang kusabab umurna pondok sareng radius difusi terbatas (t1/2 <0.6 µs dina sél)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6 µs）行他们我们们一们。 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограница и ограници / 2 хифлород. Di antara bentuk aktif, oksigén singlet narik perhatian urang kusabab umurna pondok sareng radius difusi kawates (t1/2 <0,6 μs dina sél).Oksigén singlet dilaporkeun sacara acak ngaoksidasi metionin, tirosin, histidin sareng triptofan, sahingga polar 14,15 pikeun kantétan kana panyilidikan dumasar amina atanapi tiol16,17.Sanajan oksigén singlet geus dipaké pikeun labél RNA kompartemen subsélular, strategi pikeun repurposing spidol deukeut POI endogenous tetep unexplored.Di dieu, kami nampilkeun platform anu disebut photoactivation-dependent proximity labeling (PDPL), dimana kami nganggo lampu biru pikeun nyaangan POI anu dihijikeun sareng miniSOG photosensitizer sareng memicu generasi oksigén singlet pikeun ngoksidasi résidu proksimal, dituturkeun ku modifikasi anu ngandung amina pikeun ngoksidasi panyilidikan kimiawi kana. sél hirup panengah..Urang nguji grup panyilidikan kimiawi pikeun maksimalkeun pungsi spésifisitas tag sarta ngaidentipikasi situs modifikasi ngagunakeun hiji workflow proteomics kabuka.Perbandingan sisi-demi-sisi PDPL sareng TurboID nunjukkeun sinyalna proteomik anu langkung spésifik sareng komprehensif ngeunaan PDPL.Kami nerapkeun pendekatan ieu kana spidol khusus organél tina proteome subsélular sareng idéntifikasi proteome umum tina mitra beungkeutan pikeun protéin régulasi epigenetik anu aya hubunganana sareng kanker BRD4 sareng E3 ligase Parkin anu aya hubunganana sareng panyakit Parkinson, anu dikonfirmasi duanana jaringan protéin anu dikenal sareng anu teu dipikanyaho. interaksi..Kamampuh PDPL ngakuan substrat E3 dina kompléx protéin badag ngagambarkeun kaayaan dimana pangakuan binders teu langsung diperlukeun.Dua substrat parkin anu teu dipikanyaho dimédiasi ku ubiquitination-proteasome parantos dikonfirmasi in situ.
Terapi Photodynamic (PDT) 19 jeung chromophore-assisted laser inactivation (CALI) 20, dimana iradiasi cahaya sareng photosensitizers ngahasilkeun oksigén singlet, tiasa nganonaktipkeun protéin target atanapi nyababkeun maot sél.Kusabab oksigén singlet nyaéta zat anu réaktif pisan kalayan jarak difusi téoritis kira-kira 70 nm, oksidasi kawates spasial sabudeureun photosensitizer bisa dikontrol.Dumasar kana konsép ieu, urang mutuskeun pikeun ngagunakeun oksigén singlet pikeun ngahontal panyiri caket kompléx protéin dina sél hirup.Kami geus ngembangkeun pendekatan chemoproteomic PDPL pikeun minuhan opat fungsi: (1) pikeun ngatalisan generasi oksigén singlet aktif sarupa jeung pendekatan énzimatik PL;(2) nyadiakeun panyiri waktos-direngsekeun kana inisiasi lampu;(3) ku alterasi (4) Hindarkeun ngagunakeun kofaktor endogen (sapertos biotin) pikeun ngirangan latar tukang, atanapi nganggo réagen eksogén anu ngaganggu pisan (sapertos péroxida) pikeun ngaleutikan paparan sél kana setrés lingkungan.
Photosensitizers bisa dibagi jadi dua kategori kaasup fluorophores beurat molekul leutik (misalna acuk bengal, métilén bulao)22 sarta genetik disandikeun protéin leutik (misalna miniSOG, KillerRed)23.Pikeun ngahontal desain modular, urang ngembangkeun platform PDPL generasi kahiji ku nambahkeun protéin photosensitizer (PS) kana POI24,25 (Gambar 1a).Nalika disinari ku cahaya biru, oksigén singlet ngaoksidasi résidu asam amino nukléofilik proksimal, nyababkeun polaritas umpolung anu éléktrofilik sareng salajengna tiasa ngaréaksikeun sareng nukléofil usik amina16,17.Panyilidikan dirancang kalayan gagang alkuna pikeun ngawenangkeun kimia klik sareng tarik ka handap pikeun karakterisasi LC / MS / MS.
Ilustrasi skéma tina panyiri kompléx protéin dimédiasi ku miniSOG.Nalika kakeunaan cahaya biru, sél anu nyatakeun miniSOG-POI ngahasilkeun oksigén singlet, anu ngarobih protéin anu berinteraksi tapi sanés protéin anu henteu ngariung.Produk panengah fotooksidasi dicegat ku labél relay tina usik kimia amina pikeun ngabentuk adducts kovalén.Gugus alkynyl dina usik kimia ngamungkinkeun kimia klik pikeun pengayaan ku pull-handap dituturkeun ku LC-MS / MS quantitation.b Struktur kimia usik amina 1-4.c Perwakilan analisis gél fluoresensi tina mitokondria localized miniSOG-dimédiasi spidol proteomic maké panyilidikan 1-4 jeung kuantifikasi relatif dumasar kana gél densitometry.Babandingan sinyal-ka-latar panyilidikan kimiawi ditaksir ngagunakeun ékspérimén kontrol négatip teu kalebet lampu biru atanapi nganggo sél HEK293T tanpa ekspresi miniSOG.n = 2 sampel bebas biologis.Unggal titik ngagambarkeun réplika biologis.d Deteksi perwakilan sareng kuantifikasi PDPL nganggo usik dioptimalkeun 3 dina ayana atanapi henteuna komponén PDPL anu dituduhkeun sapertos c.n = 3 sampel bebas biologis.Unggal titik ngagambarkeun réplika biologis.Garis tengah sareng kumis ngagambarkeun rata-rata sareng ± simpangan baku.CBB: Coomassie Sarwa Bulao.e Pencitraan Konfokal oksigén singlet kalayan noda Si-DMA beureum-beureum.Skala bar: 10 µm.Pencitraan gél sareng percobaan confocal sacara mandiri diulang sahenteuna dua kali kalayan hasil anu sami.
Urang mimiti nguji kamampuh potosensitizers dewasa miniSOG26 na KillerRed23, stably dinyatakeun dina HEK293T, pikeun nyapih panyiri propargylamine tina proteome salaku usik kimiawi (Suplemén Gbr. 1a).Analisis fluoresensi gél nunjukkeun yén panyiri proteome sadayana dihontal nganggo miniSOG sareng iradiasi cahaya biru, sedengkeun henteu aya produk panyiri anu katingali ku KillerRed.Pikeun ningkatkeun rasio sinyal-ka-tukang, urang teras nguji sakumpulan panyilidikan kimiawi anu ngandung anilin (1 sareng 3), propylamine (2), atanapi benzylamine (4).Urang niténan yén sél HEK293T sorangan miboga sinyal tukang leuwih luhur dibandingkeun euweuh lampu biru, jigana alatan endogenous riboflavin photosensitizer, flavin mononucleotide (FMN) 27. Panyilidikan kimiawi dumasar-aniline 1 sareng 3 masihan spésifisitas anu langkung saé, kalayan HEK293T sacara stabil ngémutan miniSOG dina mitokondria nunjukkeun paningkatan> 8 kali lipet dina sinyal pikeun usik 3, sedengkeun panyilidikan 2 dianggo dina metode RNA-labeling CAP-seq ngan ukur nunjukkeun ~2.5- kanaékan sinyal melu, kamungkinan alatan karesep réaktivitas béda antara RNA jeung protéin (Gbr. 1b, c). Panyilidikan kimiawi dumasar-aniline 1 sareng 3 masihan spésifisitas anu langkung saé, kalayan HEK293T sacara stabil ngémutan miniSOG dina mitokondria nunjukkeun paningkatan> 8 kali lipet dina sinyal pikeun usik 3, sedengkeun panyilidikan 2 dianggo dina metode RNA-labeling CAP-seq ngan ukur nunjukkeun ~2.5- kanaékan sinyal melu, kamungkinan alatan karesep réaktivitas béda antara RNA jeung protéin (Gbr. 1b, c).Panyilidikan kimiawi dumasar-aniline 1 sareng 3 nunjukkeun spésifisitas anu langkung saé: HEK293T, anu sacara stabil nganyatakeun miniSOG dina mitokondria, nunjukkeun langkung ti paningkatan 8-melu dina sinyal pikeun panyilidikan 3, sedengkeun panyilidikan 2, dianggo dina metode panyiri RNA CAP-seq, ngan ukur. nembongkeun ~2,5-melu kanaékan sinyal, meureun alatan karesep réaktivitas béda antara RNA jeung protéin (Gbr. 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有具有 更 更好更的更的 好好特异性, hek293t 在 中 q 的 q q q q q q q q q q 1 仅 q q q q q q q q q> 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNApanyilidikan kimiawi basis Aniline 1 jeung 3 miboga spésifisitas hadé, HEK293T stably dikedalkeun miniSOG dina mitokondria, sarta usik 3 miboga leuwih 8-melu kanaékan sinyal, bari usik 2 pikeun métode panyiri RNA CAP-seq némbongkeun ukur ~ 2.5 -fold kanaékan.dina sinyal, meureun alatan karesep réaksi béda antara RNA jeung protéin (Gbr. 1b, c).Sajaba ti éta, usik 3 isomér jeung hydrazine usik (usik 5, 6, 7) diuji, confirming optimasi usik 3 (Suplemén Gbr. 1b, c).Nya kitu, analisis fluoresensi in-gél ngungkabkeun parameter ékspérimén anu dioptimalkeun sanésna: panjang gelombang iradiasi (460 nm), konsentrasi usik kimiawi (1 mM), sareng waktos iradiasi (20 mnt) (Suplemén Gbr. 2a-c).Omitting sagala komponén atawa hambalan dina protokol PDPL nyababkeun ngabalikeun sinyal signifikan ka tukang (Gbr. 1d).Utamana, panyiri protéin dikirangan sacara signifikan ku ayana natrium azida atanapi trolox, anu dipikanyaho ngaleungitkeun oksigén singlet.Ayana D2O, anu dipikanyaho pikeun nyaimbangkeun oksigén singlet, ningkatkeun sinyal panyiri.Pikeun nalungtik kontribusi spésiés oksigén réaktif séjén pikeun panyiri, mannitol jeung vitamin C ditambahkeun pikeun ngadegkeun hidroksil jeung superoxide scavengers radikal, masing-masing, 18, 29, tapi maranéhna teu kapanggih ngurangan panyiri.Nambahan H2O2, tapi teu katerangan, teu ngahasilkeun panyiri (Suplemén Gbr. 3a).Pencitraan oksigén singlet fluoresensi sareng panyilidikan Si-DMA dikonfirmasi ayana oksigén singlet dina kawat HEK293T-miniSOG, tapi henteu dina kawat HEK293T asli.Sajaba ti éta, mitoSOX Beureum teu bisa ngadeteksi produksi superoxide sanggeus katerangan (Gbr. 1e na Suplemén Gbr. 3b) 30. Data ieu niatna nyarankeun yén oksigén singlet mangrupakeun spésiés oksigén réaktif utama jawab panyiri proteomic saterusna.Cytotoxicity of PDPL ieu ditaksir kaasup irradiation lampu biru jeung panyilidikan kimiawi, sarta euweuh cytotoxicity signifikan ieu observasi (Suplemén Gbr. 4a).
Pikeun diajar mékanisme panyiri sareng ngaktifkeun idéntifikasi proteomik kompléx protéin nganggo LC-MS / MS, urang kedah terang heula mana asam amino anu dirobih sareng massa délta labél usik.Methionine, histidine, triptofan jeung tirosin geus dilaporkeun bisa dirobah ku oksigén singlet14,15.Urang ngahijikeun workflow TOP-ABPP31 jeung pilarian kabuka unbiased disadiakeun ku platform komputasi FragPipe dumasar kana MSFragger32.Saatos modifikasi oksigén singlet sareng panyiri kimiawi, kimia klik dilaksanakeun nganggo labél réduksi biotin anu ngandung tautan anu tiasa dipisahkeun, dituturkeun ku peregangan neutravidin sareng nyerna tripsin.Péptida anu dirobih, masih kabeungkeut kana résin, dipoto pikeun analisis LC-MS / MS (Gambar 2a sareng Data Suplemén 1).Sajumlah badag modifikasi lumangsung sapanjang proteome kalawan leuwih 50 peta péptida (PSM) cocog didaptarkeun (Gbr. 2b).Ahéng, urang ngan observasi modifikasi tina histidine, meureun alatan réaktivitas luhur histidine dioksidasi kana panyilidikan aniline ti asam amino lianna.Numutkeun mékanisme diterbitkeun tina oksidasi histidine ku oksigén singlet, 21,33 struktur massa délta diusulkeun +229 Da pakait jeung adduct of usik 3 kalawan 2-oxo-histidine sanggeus dua oksidasi, sedengkeun +247 Da nyaéta produk hidrolisis. tina +229 Da (Suplemén Gbr. 5).Evaluasi spéktrum MS2 némbongkeun reliabiliti luhur idéntifikasi lolobana ion y jeung b, kaasup idéntifikasi ion fragmén dirobah (y jeung b) (Gbr. 2c).Analisis kontéks tina sekuen lokal histidines dirobah PDPL ngungkabkeun leuwih sering dipake tinimbang motif sedeng pikeun résidu hidrofobik leutik dina ± 1 posisi (Suplemén Gbr. 4b).Rata-rata, 1.4 histidines diidentipikasi per protéin, sarta situs tina spidol ieu ditangtukeun ku pangleyur aréa permukaan diaksés (SASA) jeung kasadiaan pangleyur relatif (RSA) analisis (Suplemén Gbr. 4c, d).
Alur kerja anu teu bias pikeun diajar selektivitas sésa ngagunakeun platform komputasi FragPipe anu didamel ku MSFragger.Linkers Cleavable dipaké dina Kimia Klik pikeun ngidinan photocleavage of péptida dirobah tina résin streptavidin.Pilarian kabuka diluncurkeun pikeun ngaidentipikasi seueur modifikasi, ogé sésa-sésa anu relevan.b Netepkeun massa modifikasi lumangsung sapanjang proteome nu.PSM pemetaan péptida.c MS2 annotation spéktral situs histidine dirobah ku usik 3. Salaku conto wawakil, réaksi kovalén kalawan usik 3 ditambahkeun +229,0938 Da kana asam amino dirobah.d assay mutasi dipaké pikeun nguji pikeun spidol PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) jeung PRDX1 (H10A, H81A, H169A) ieu transfected kalawan liar-tipe plasmid pikeun deteksi anti Bandéra.e Péptida sintétik ieu diréaksikeun jeung miniSOG dimurnikeun ku ayana usik 3 jeung produk pakait jeung Δm +247 jeung +229 nyatet dina spéktrum LC-MS.f Interaksi protéin-ka-protéin in vitro dimodelkeun ku miniSOG-6xHis-tag sareng antibodi anti-6xHis.Antibiotin (streptavidin-HRP) jeung anti-mouse analisis Western blot miniSOG-6xHis / anti-6xHis kompléx antibodi dilabélan ku usik 3, gumantung kana waktu paparan ka lampu.Labél pikeun protéin individu dinyatakeun dina beurat molekul anu saluyu: ranté lampu antibodi LC, ranté beurat antibodi HC.Percobaan ieu diulang sacara mandiri sahenteuna dua kali kalayan hasil anu sami.
Pikeun verifikasi biokimiawi situs panyiri, PRDX3 sareng PRDX1 anu diidentipikasi ku spéktrometri massa dirobih tina histidin ka alanin sareng dibandingkeun sareng jinis liar dina uji transfeksi.Hasil PDPL némbongkeun yén mutasi nyata ngurangan panyiri (Gbr. 2d).Samentara éta, sekuen péptida anu diidentipikasi dina pilarian kabuka disintésis sarta diréaksikeun in vitro kalawan miniSOG dimurnikeun ku ayana usik 3 jeung lampu bulao, ngahasilkeun produk kalawan shift massa +247 na +229 Da lamun kauninga ku LC-MS (Gbr. . 2e).).Pikeun nguji naha interaksi protéin proksimal bisa dilabélan in vitro dina respon kana miniSOG photoactivation, urang dirancang hiji assay deukeut jieunan ku interaksi antara protéin miniSOG-6xHis jeung antibodi monoclonal anti-Na in vitro (Gambar 2f).Dina assay ieu, kami ngarepkeun labél proksimal tina ranté beurat sareng ringan antibodi sareng miniSOG.Kanyataanna, anti-mouse (ngawanohkeun ranté beurat jeung lampu tina antibodi anti-6xHis-dilabélan) jeung streptavidin Western blots némbongkeun biotinilasi kuat tina ranté beurat jeung lampu.Utamana, urang perhatikeun autobiotinylation miniSOG alatan tag 6xHis sareng cross-link antara ranté lampu sareng beurat, anu tiasa aya hubunganana sareng gap anu dijelaskeun sateuacana antara lisin sareng réspon proksimal 2-oxo-histidine.Dina kacindekan, urang disimpulkeun yén PDPL modifies histidine dina cara gumantung jarak.
Tujuan kami salajengna nyaéta pikeun ngacirian proteome subsélular pikeun nguji spésifisitas labél in situ.Kituna, urang stably dikedalkeun miniSOG dina inti, matrix mitokondria, atawa mémbran ER luar sél HEK293T (Gbr. 3a).Analisis fluoresensi gél ngungkabkeun pita anu dilabélan seueur pisan dina tilu lokasi subsélular ogé pola panyiri anu béda (Gbr. 3b).Analisis Imaging fluoresensi némbongkeun spésifisitas luhur PDPL (Gbr. 3c).The workflow PDPL ieu dituturkeun ku réaksi klik kalawan dyes rhodamine mun delineate proteomes subsélular ngagunakeun mikroskop fluoresensi, sarta sinyal PDPL anu colocalized kalawan DAPI, trackers mitokondria, atawa trackers ER, confirming kasatiaan luhur PDPL.Pikeun tilu lokasi organél, perbandingan sisi-demi-sisi PDPL kalawan TurboID ngagunakeun avidin western blot némbongkeun yén PDPL ieu dilabélan leuwih husus dibandingkeun kadali masing-masing.Dina kaayaan PDPL, langkung seueur pita anu dilabélan muncul, nunjukkeun langkung seueur protéin anu dilabélan PDPL (Suplemén Gbr. 6a-d).
a Répréséntasi Schematic of labél proteome organél-spésifik miniSOG-dimédiasi.miniSOG nargétkeun matriks mitokondria ngaliwatan fusi ka N-terminal 23 asam amino COX4 manusa (mito-miniSOG), inti ngaliwatan fusi ka H2B (nukleus-miniSOG), sarta Sec61β ngaliwatan sisi sitoplasma mémbran ER (ER-miniSOG). ).Indikasi kalebet pencitraan gél, pencitraan confocal, sareng spéktrometri massa.b Gambar gél wawakil tilu propil PDPL organél-spésifik.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Gambar confocal wawakil sél HEK293T stably nganyatakeun miniSOG kalawan lokalisasi subsélular béda kauninga ku antibodi dilabélan V5 (beureum).spidol subsélular dipaké pikeun mitokondria jeung ER (héjo).The PDPL workflow ngawengku deteksi miniSOG (konéng) proteomes subsélular dilabélan ngagunakeun Cy3-azide klik kimia.Skala bar: 10 µm.d Plot vulkanik tina proteomes ditandaan PDPL dina rupa-rupa organél diitung ku kuantifikasi unlabeled (n = 3 percobaan biologis bebas).Uji t Student dua buntut digunakeun dina plot gunung.HEK293T tipe liar ieu dipaké salaku kontrol négatip. Protéin anu robih sacara signifikan disorot ku warna beureum (p <0.05 sareng> bédana inténsitas ion 2-melu). Protéin anu robih sacara signifikan disorot ku warna beureum (p <0.05 sareng> bédana inténsitas ion 2-melu). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Protéin anu dirobih sacara signifikan disorot ku warna beureum (p <0.05 sareng> bédana 2 kali lipet dina inténsitas ion).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Protéin anu dirobih sacara signifikan disorot ku warna beureum (p <0,05 sareng > bédana 2 kali lipet dina kakuatan ionik).Protéin patali penting pikeun HEK293T-miniSOG tapi teu penting pikeun HEK293T ditémbongkeun dina héjo.e Analisis spésifisitas set data proteomik tina percobaan d.Jumlah total protéin anu signifikan sacara statistik dina unggal organél (titik beureum sareng héjo) ditandaan di luhur.Histograms nembongkeun protéin localized dina organél dumasar kana MitoCarta 3.0, analisis GO jeung A. Ting et al.jalma.Dataset misah pikeun mitokondria, inti, sareng ER.Percobaan ieu diulang sacara mandiri sahenteuna dua kali kalayan hasil anu sami.Data atah disayogikeun dina bentuk file data atah.
Didorong ku hasil gél sareng pencitraan, kuantifikasi bébas labél dianggo pikeun ngitung proteome anu diidentifikasi dina unggal organél (Data Tambahan 2).HEK293T anu henteu ditransféksi dianggo salaku kontrol négatip pikeun ngirangan spidol latar. Analisis plot gunung seuneuan ditampilkeun protéin enriched nyata (p <0,05 jeung> 2-melu inténsitas ion) kitu ogé protéin singleton nu ngan aya dina garis miniSOG-ekspresi (Gbr. 3d titik beureum jeung héjo). Analisis plot gunung seuneuan ditampilkeun protéin enriched nyata (p <0,05 jeung> 2-melu inténsitas ion) kitu ogé protéin singleton nu ngan aya dina garis miniSOG-ekspresi (Gbr. 3d titik beureum jeung héjo). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Analisis plot gunung api némbongkeun protéin enriched nyata (p<0.05 jeung> 2-melu inténsitas ion) kitu ogé protéin tunggal nu ngan aya dina garis miniSOG-ekspresi (Gbr. 3d, titik beureum jeung héjo).火山图分析显示出显着富集的蛋白质（p < 0.05 和>2 倍离子强度）以及仅存在于miniSOG 表达系中的单一蛋白质（图3d 红色和绿色点）。火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 (P <0.05 Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Analisis plot gunung api ngungkabkeun protéin anu diperkaya sacara signifikan (p<0.05 sareng> 2x kakuatan ionik) ogé protéin tunggal ngan ukur aya dina garis éksprési miniSOG (titik beureum sareng héjo dina Gbr. 3d).Ngagabungkeun data ieu, urang ngaidentipikasi 1364, 461, sarta 911 statistik signifikan nuklir, mitokondria, sarta ER protéin mémbran luar, mungguh.Pikeun nganalisis akurasi PDPL organél-lokal, kami dipaké MitoCarta 3.0, analisis Gene Ontology (GO), sarta A. Ting et al.data set8 dipaké pikeun mitokondria, inti, jeung ER pikeun nguji spésifisitas organél protéin nu dideteksi, pakait jeung akurasi 73,4, 78,5, jeung 73,0% (Gbr. 3e).Spésifisitas PDPL negeskeun yén PDPL mangrupikeun alat anu idéal pikeun ngaidentipikasi proteomes khusus organél.Utamana, analisis submitochondrial protéin mitokondria dicirikeun némbongkeun yén proteome trapped ieu utamana disebarkeun dina matrix jeung mémbran jero (masing-masing 226 jeung 106), akuntansi pikeun 91,7% (362) tina total jumlah protéin mitokondria dicirikeun.tingkat luhur PDPL ieu Sajaba dikonfirmasi (Suplemén Gbr. 7a).Nya kitu, analisis subnuclear némbongkeun yén proteome kawengku ieu utamana disebarkeun dina inti, nucleoplasm, jeung nucleolus (Suplemén Gbr. 7b).Analisis proteomik nuklir sareng péptida sinyal lokalisasi nuklir (3xNLS) nunjukkeun akurasi anu sami sareng konstruksi H2B (Suplemén Gbr. 7c-h).Pikeun nangtukeun spésifisitas tina spidol PDPL, laminin nuklir A dipilih salaku bubu POI7 leuwih discretely localized.PDPL ngaidentipikasi 36 protéin sacara signifikan enriched, nu 12 protéin (30,0% kaasup lamin A) anu well-dicirikeun lamin A interaksi protéin annotated ku database String, kalawan perséntase luhur batan métode BioID (122 protéin) 28 ti 28, 22,9 %) 7. Metoda kami ngaidentipikasi langkung saeutik protéin, kamungkinan kusabab daérah panyiri anu terbatas, anu dimungkinkeun ku oksigén singlet anu langkung aktip.Analisis GO nunjukkeun yén protéin anu diidentifikasi utamina aya dina nukléoplasma (26), mémbran inti (10), mémbran inti (9), sareng pori nuklir (5).Sacara koléktif, protéin anu dilokalkeun nuklir ieu nyababkeun 80% tina protéin anu diperkaya, teras nunjukkeun spésifisitas PDPL (Supplementary Gbr. 8a-d).
Sanggeus netepkeun kamampuan PDPL pikeun ngalakukeun nyirian jarak dina organél, kami teras nguji naha PDPL tiasa dianggo pikeun nganalisis mitra beungkeutan POI.Khususna, urang narékahan pikeun ngartikeun analisa PDPL protéin sitosolik, anu dianggap target anu langkung hese tibatan mitra lokal-mémbranna kusabab sifatna anu dinamis pisan.Bromodomain sareng extraterminal (BET) protéin BRD4 parantos narik perhatian urang pikeun peran konci na dina sagala rupa panyakit 35, 36.Kompleks anu dibentuk ku BRD4 mangrupikeun coactivator transkripsional sareng target terapi anu penting.Ku régulasi éksprési faktor transkripsi c-myc sareng Wnt5a, BRD4 diduga janten determinan konci leukemia myeloid akut (AML), sababaraha myeloma, limfoma Burkitt, kanker usus besar sareng panyakit radang37,38.Salaku tambahan, sababaraha virus nargétkeun BRD4 pikeun ngatur transkripsi virus sareng sélular, sapertos papillomavirus, HIV, sareng SARS-CoV-236,39.
Pikeun peta interaksi BRD4 ngagunakeun PDPL, kami ngagabungkeun miniSOG sareng N- atanapi C-terminal isoform pondok tina BRD4.Hasil Protéomic nembongkeun tingkat luhur tumpang tindihna antara dua constructs (Suplemén Gbr. 9a).Protéome nuklir anu dicirikeun ku miniSOG-H2B nyertakeun 77.6% protéin anu berinteraksi sareng BRD4 (Suplemén Gbr. 9b).Lajeng, kali béda tina katerangan (2, 5, 10, 20 mnt) anu dipaké pikeun nyaluyukeun radius spidol (Gbr. 4a jeung data suplemén 3).Urang nyimpulkeun yén dina photoperiods pondok, PDPL utamana bakal labél mitra mengikat langsung, bari perioda panjang bakal kaasup protéin dicirikeun salila période photoactivation pondok ogé target teu langsung dina kompléx labél.Kanyataanna, kami kapanggih tumpang tindihna kuat antara titik waktu padeukeut (84.6% keur 2 na 5 mnt; 87.7% keur 5 na 10 mnt; 98.7% keur 10 na 20 mnt) (Gbr. 4b jeung Suplemén Gbr. 9c).Dina sakabéh grup ékspérimén, urang kapanggih teu ukur BRD4 timer labél, tapi sababaraha target dipikawanoh kayaning MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, sarta HMGB1 annotated dina database string.Kakuatan ionik target ieu sabanding sareng waktos paparan (Gbr. 4c sareng Gambar Tambahan 9d).Analisis GO tina protéin anu diidentipikasi dina grup 2-menit nunjukkeun yén protéin anu diidentifikasi dilokalkeun dina inti sareng aub dina remodeling kromatin sareng fungsi polimérase RNA.Fungsi molekular protéin ieu enriched dina beungkeutan kromatin atawa coactivation transcriptional, konsisten jeung fungsi BRD4 (Gbr. 4d).Analisis interaksi protéin anu diaktipkeun basis data string ngungkabkeun tingkat mimiti interaksi teu langsung antara BRD4 sareng HDAC kulawarga kompléx interaksi sapertos SIN3A, NCOR2, BCOR, sareng SAP130 (Gbr. 4e sareng Gambar Tambahan 9e), konsisten sareng BRD4 sareng HDAC ngabeungkeut histones acetylated. ..Sajaba ti éta, target wawakil dicirikeun ku LC-MS / MS, kaasup Sin3A, NSUN2, Fus, sarta SFPQ, dikonfirmasi ku Western blotting (Gbr. 4f).Anyar-anyar ieu, isoform pondok BRD4 parantos dilaporkeun ngabentuk inti kalayan sipat pamisahan fase cair-cair (LLPS).Protéin pengikat RNA Fus sareng SFPQ nyapih LLPS tina rupa-rupa prosés sélulér sareng parantos diidentifikasi di dieu salaku protéin BRD4 anu teu kacatet.Interaksi antara BRD4 na SFPQ dikonfirmasi ku co-immunoprecipitation (co-IP) percobaan (Gambar 4g), suggesting mékanisme séjén pikeun BRD4-dimédiasi fase cair-cair deserving panalungtikan salajengna.Dihijikeun, hasil ieu nunjukkeun yén PDPL mangrupikeun platform idéal pikeun ngaidentipikasi BRD4 anu berinteraksi sareng protéin anu teu dipikanyaho.
a Répréséntasi Schematic of miniSOG-dimédiasi BRD4 deukeut nyirian, kali paparan: 2, 5, 10, jeung 20 mnt.b Tumpang tindihna protéin dicirikeun dina waktu katerangan béda.Pengayaan protéin anu diidentifikasi dina HEK293T-miniSOG-BRD4 signifikan sacara statistik dibandingkeun sareng HEK293T tipe liar.c Inténsitas ion nalika ngitung wawakil unlabelled protéin BRD4-ngabeungkeut dipikawanoh salila waktu paparan dieusian.n = 3 sampel bebas biologis.Data dibere rata-rata ± simpangan baku.d Analisis ontological gén (GO) protéin dicirikeun dina grup 2-menit.Sapuluh istilah GO munggaran didaptarkeun.Gelembung diwarnaan dumasar kana kategori istilah GO, sareng ukuran gelembung sabanding sareng jumlah protéin anu aya dina unggal istilah.e Analisis string protéin berinteraksi sareng BRD4.Bunderan konéng nyaéta lem langsung jeung bunderan kulawu nyaéta lapisan kahiji lem teu langsung.Garis beureum ngagambarkeun interaksi anu ditangtukeun sacara ékspériméntal sareng garis biru ngagambarkeun interaksi anu diprediksi.f Perwakilan BRD4 beungkeutan target dicirikeun dina LC-MS / MS anu diverifikasi ku Western blotting.g percobaan Co-immunoprecipitation mastikeun interaksi antara SFPQ na BRD4.Percobaan ieu diulang sacara mandiri sahenteuna dua kali kalayan hasil anu sami.Data atah disayogikeun dina bentuk file data atah.
Salian ti ngaidentipikasi target pakait POI anu teu kadaptar, kami hipotésis yén PDPL bakal cocog pikeun ngaidentipikasi substrat pikeun énzim, anu bakal meryogikeun karakterisasi protéin anu ngariung teu langsung dina kompléx ageung pikeun ngémutan substrat anu henteu kadaptar.Parkin (disandi ku PARK2) nyaéta ligase E3 sareng mutasi dina parkin dipikanyaho nyababkeun panyakit Parkinson juvenile autosomal recessive (AR-JP)42.Sajaba ti éta, parkin geus digambarkeun penting pisan pikeun mitophagy (mitochondrial autophagy) jeung ngaleupaskeun spésiés oksigén réaktif.Sanajan kitu, sanajan sababaraha substrat parkin geus dicirikeun, peran parkin dina kasakit ieu tetep can écés.Pikeun annotate substrat uncharacterized na, PDPL diuji ku nambahkeun miniSOG kana N- atawa C-terminus parkin.Sél dirawat ku transporter proton karbonil sianida m-chlorophenylhydrazone (CCCP) pikeun ngaktipkeun parkin ngaliwatan jalur PINK1-Parkin.Dibandingkeun sareng hasil BRD4 PDPL kami, fusi N-terminus parkin ngungkabkeun set protéin target anu langkung ageung, sanaos nutupan bagian anu langkung ageung tina C-terminus (177 kaluar tina 210) (Gambar 5a, b sareng Data Suplemén 4).hasilna konsisten kalayan laporan yén tag N-terminal bisa aberrantly ngaktipkeun Parkin44.Ahéngna, ngan aya 18 protéin anu tumpang tindih dina data kami sareng hasil AP-MS anu diterbitkeun pikeun Parkin43, sigana kusabab bédana antara garis sél sareng alur kerja proteomik.Salian opat protéin dipikawanoh (ARDM1, HSPA8, PSMD14, sarta PSMC3) dicirikeun ku dua métode (Gbr. 5c)43.Jang meberkeun validasi hasil LC-MS / MS, perlakuan PDPL sarta blotting Kulon saterusna dipaké pikeun ngabandingkeun hasil tina HEK293T sél indungna assay jeung stabil N-terminal parkin garis.Saméméhna target kanyahoan CDK2, DUT, CTBP1, sarta PSMC4 diuji ku map dipikawanoh, DNAJB1 (Gbr. 5d).
Plot gunung seuneuan protéin interaksi parkin dina sél HEK293T kalawan miniSOG dikedalkeun stably ngahiji ka N- atawa C-terminus parkin (n = 3 percobaan biologis bebas).Uji t Student dua buntut digunakeun dina plot gunung.HEK293T dipaké salaku kontrol négatip. Protéin anu robih sacara signifikan disorot ku warna beureum (p <0.05 sareng> bédana inténsitas ion 2-melu). Protéin anu robih sacara signifikan disorot ku warna beureum (p <0.05 sareng> bédana inténsitas ion 2-melu). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Protéin anu dirobih sacara signifikan disorot ku warna beureum (p <0.05 sareng> bédana 2 kali lipet dina inténsitas ion).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Protéin anu dirobih sacara signifikan disorot ku warna beureum (p <0,05 sareng > bédana 2 kali lipet dina kakuatan ionik).Protéin patali penting pikeun HEK293T-miniSOG tapi teu penting pikeun HEK293T ditémbongkeun dina héjo.b diagram Venn némbongkeun tumpang tindihna protéin antara N-terminal jeung C-terminal constructs.tag N-terminal bisa aberrantly ngaktipkeun parkin sarta ngahasilkeun protéin leuwih recognizable.c diagram Venn némbongkeun tumpang tindihna protéin antara PDPL jeung AP-MS.Interaktor anu dipikanyaho didaptarkeun, kalebet 4 tina 18 protéin anu tumpang tindih sareng 11 tina 159 protéin anu diidentifikasi sacara khusus dina PDPL.d target Perwakilan dicirikeun ku LC-MS / MS anu diverifikasi ku Western blotting.e Ssu72 sareng SNW1 diidentifikasi minangka substrat parkin anu teu kadaptar.Plasmid protéin anu ditandaan FLAG ieu dialihkeun kana HEK293T sareng HEK293T-Parkin-miniSOG dituturkeun ku perlakuan CCCP dina sababaraha waktos waktos.Degradasi ieu langkung jelas dina garis overexpression Parkin.f Nganggo inhibitor proteasome MG132, dikonfirmasi yén prosés degradasi Ssu72 sareng SNW1 dimédiasi ku proteasome-ubiquitination.Percobaan ieu diulang sacara mandiri sahenteuna dua kali kalayan hasil anu sami.Data atah disayogikeun dina bentuk file data atah.
Utamana, protéin anu diidentipikasi ku PDPL kedah kalebet protéin anu ngariung parkin sareng substratna.Pikeun ngadeteksi substrat parkin anu henteu kadaptar, kami milih tujuh protéin anu diidentifikasi (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 sareng SNW1) sareng plasmid anu ditransféksi pikeun ngalaan gen ieu kana HEK293T normal sareng sacara stabil nganyatakeun miniSOG-Parkin HEK293T dituturkeun ku perlakuan CCCP.Tingkat protéin Ssu72 na SNW1 anu nyata ngurangan dina garis stabil miniSOG-Parkin (Gbr. 5e).Perlakuan sareng CCCP salami 12 jam nyababkeun degradasi anu paling signifikan tina duanana substrat.Pikeun nalungtik naha degradasi Ssu72 na SNW1 diatur ku proteasome-ubiquitination, inhibitor proteasome MG132 ditambahkeun pikeun ngahambat aktivitas proteasome, sarta dina kanyataanana urang kapanggih yén prosés degradasi maranéhanana dipeungpeuk (Gbr. 5f).Target non-substrat tambahan dikonfirmasi salaku interaksi Parkin maké Western blotting (Suplemén Gbr. 10), nu némbongkeun hasil konsisten kalayan LC-MS / MS.Dina kacindekan, integrasi workflow PDPL kalawan verifikasi transfection protéin target ngamungkinkeun idéntifikasi unregistered E3 substrat ligase.
Kami parantos ngembangkeun platform nyirian jarak anu umum anu ngamungkinkeun anjeun pikeun ngaidentipikasi POI anu berinteraksi dina rohangan sareng waktos.Platform ieu dumasar kana protéin miniSOG photosensitizer, nu ngan ngeunaan 12 kDa, kirang ti satengah ukuran énzim APEX2 dewasa (27 kDa) jeung sapertilu ukuran TurboID (35 kDa).Ukuran anu langkung alit kedah seueur ngalegaan jangkauan aplikasi pikeun diajar interaksi protéin leutik.Éksplorasi salajengna ngeunaan photosensitizers tambahan, naha protéin disandi genetik atawa molekul leutik, diperlukeun pikeun ngaronjatkeun ngahasilkeun kuantum oksigén singlet tur ngalegaan sensitipitas pendekatan ieu.Pikeun vérsi miniSOG ayeuna, résolusi temporal anu luhur tiasa dihontal nganggo katerangan biru pikeun ngaktipkeun spidol jarak.Salaku tambahan, waktos paparan anu langkung panjang ngaluarkeun "awan" oksigén singlet anu langkung ageung, nyababkeun modifikasi résidu histidin anu langkung jauh, ningkat radius panyiri, sareng kamampuan pikeun nyaluyukeun résolusi spasial PDPL.Kami ogé nguji tujuh panyilidikan kimiawi pikeun ningkatkeun rasio sinyal-ka-tukang sareng ngajalajah mékanisme molekular di tukangeun pendekatan ieu.The TOP-ABPP workflow digabungkeun jeung pilarian kabuka unbiased dikonfirmasi yén modifikasi lumangsung ngan dina histidines tur euweuh microenvironment konsisten ieu observasi pikeun ngaronjat modifikasi histidine, iwal hiji leuwih sering dipake tinimbang sedeng pikeun histidines di wewengkon loop.
PDPL ogé geus dipaké pikeun ngacirian proteomes subsélular kalawan spésifisitas proteome jeung sinyalna sahenteuna comparable kana panyiri deukeut jeung organél-spésifik métode usik kimiawi lianna.spidol jarak ogé geus hasil dipaké pikeun characterize beungeut, lysosomal, sarta proteomes nu patali secretome46,47.Kami yakin yén PDPL bakal cocog sareng organél subsélular ieu.Salaku tambahan, urang nantang PDPL ku ngaidentipikasi target pikeun beungkeutan protéin cytosolic anu langkung kompleks tibatan protéin kabeungkeut mémbran kusabab sipat dinamis sareng kalibet dina interaksi anu langkung temporal.PDPL ieu dilarapkeun ka dua protéin, nu coactivator transcriptional BRD4 jeung kasakit-pakait ligase E3 Parkin.Dua protéin ieu dipilih henteu ngan ukur pikeun fungsi biologis dasarna, tapi ogé pikeun relevansi klinis sareng poténsi terapi.Pikeun dua POI ieu, mitra ngariung anu terkenal ogé target anu teu kadaptar diidentifikasi.Utamana, protéin anu aya hubunganana sareng pamisahan fase SFPQ dikonfirmasi ku co-IP, anu tiasa nunjukkeun mékanisme énggal dimana BRD4 (isoform pondok) ngatur LLPS.Dina waktos anu sami, kami yakin yén idéntifikasi substrat Parkin mangrupikeun skénario dimana idéntifikasi napel teu langsung diperyogikeun.Kami ngaidentipikasi dua substrat parkin anu teu dipikanyaho sareng dikonfirmasi degradasina sapanjang jalur ubiquitination-proteasome.Anyar-anyar ieu, strategi perangkap dumasar-mékanisme parantos dikembangkeun pikeun ngadeteksi substrat hidrolase ku cara nangkep aranjeunna ku énzim.Sanajan ieu métode anu pohara kuat, teu cocog pikeun analisis substrat aub dina formasi kompléx badag sarta merlukeun formasi beungkeut kovalén antara énzim jeung substrat.Kami ngarepkeun yén PDPL tiasa diperpanjang pikeun diajar kompléx protéin sareng kulawarga énzim sanés, sapertos kulawarga deubiquitinase sareng metalloprotease.
Bentuk anyar miniSOG, anu disebut SOPP3, parantos dikembangkeun kalayan ningkat produksi oksigén singlet.Urang ngabandingkeun miniSOG kalawan SOPP3 sarta kapanggih ningkat kinerja nyirian, sanajan rasio sinyal-to-noise tetep unchanged (Suplemén Gbr. 11).Urang hipotésis yén optimasi SOPP3 (contona, ngaliwatan évolusi diarahkeun) bakal ngakibatkeun protéin photosensitizer leuwih efisien nu merlukeun waktu cahaya pondok sahingga ngidinan prosés sélular leuwih dinamis bisa direbut.Utamana, versi PDPL ayeuna dugi ka lingkungan sélulér sabab butuh katerangan cahaya biru sareng teu tiasa nembus jaringan jero.fitur ieu precludes pamakéan na dina studi model sato.Sanajan kitu, kombinasi optogenetics jeung PDPL bisa nyadiakeun kasempetan pikeun panalungtikan sato, utamana dina uteuk.Sajaba ti éta, photosensitizers infra red direkayasa séjén ogé ngaleungitkeun watesan ieu.Panalungtikan ayeuna keur lumangsung di wewengkon ieu.
Garis sél HEK293T dicandak tina ATCC (CRL-3216).Garis sél diuji négatip pikeun inféksi mycoplasma sareng dibudidayakeun dina DMEM (Thermo, #C11995500BT) ditambah ku 10% sérum bovine fetal (FBS, Vistech, #SE100-B) sareng 1% pénisilin / streptomycin (Hyclone, #SV30010).tumuwuh di.
3-Aminophenylene (sampel 3) jeung (4-éthynylphenyl) métanamina (sampel 4) dibeuli ti Bidepharm.Propylamine (usik 2) ieu dibeuli ti Energy-kimia.N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamide (usik 1) disintésis nurutkeun métode diterbitkeun.
Suplemén Table 1 daptar constructs genetik dipaké dina ulikan ieu.Sekuen miniSOG sareng KillerRed diklon tina plasmid hadiah ti P. Zou (Universitas Peking).Urutan targeting matriks mitokondria diturunkeun tina 23 asam amino terminal N COX4 sareng diklon kana vektor anu dituduhkeun nganggo rakitan Gibson (Beyotime, #D7010S).Pikeun nargétkeun mémbran sareng inti rétikulum éndoplasma, SEC61B DNA manusa (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) diamplifikasi ku PCR tina perpustakaan cDNA sél HEK293T, sareng DNA H2B (disumbangkeun ku D. Lin, Laboratorium Teluk Shenzhen) sarta dikloning , sakumaha disebutkeun di luhur.Iwal mun disebutkeun béda, gén protéin séjén dipaké pikeun transfection sarta pangwangunan garis sél stabil anu PCR amplified tina perpustakaan cDNA sél HEK293T.G3S (GGGS) sareng G4S (GGGGS) dianggo salaku panyambung antara protéin umpan sareng miniSOG.A tag epitope V5 (GKPIPNPLLGLDST) ditambahkeun kana ieu constructs fusi.Pikeun éksprési dina mamalia sareng ngadamel garis sél anu stabil, konstruk fusi miniSOG disubklonkeun kana vektor lentiviral pLX304.Pikeun éksprési baktéri, miniSOG diklon kana vektor pET21a dilabélan 6xHis di C-terminus.
Sél HEK293T diturunkeun dina 2.0 x 105 sél per sumur dina pelat genep sumur sareng ditransfeksi 24 jam saatos nganggo plasmid lentiviral rekombinan (2.4 μg pLX304) sareng plasmid bungkusan virus (1.5 μg psPAX2 sareng 1.2 μg pMD2.G00) , #C0533), kira-kira 80% fusi.Saatos transfection sapeuting, médium diganti sareng diinkubasi salami 24 jam deui.Koléksi virus dilaksanakeun saatos 24, 48 sareng 72 jam.Saacanna inféksi tina garis sél target, medium viral ieu disaring ngaliwatan filter 0.8 μm (Merck, #millex-GP) jeung polybrene (Solarbio, #H8761) ditambahkeun kana konsentrasi 8 μg / ml.Saatos 24 jam, sél diidinan pulih ku cara ngarobah médium.Sél anu dipilih ngagunakeun 5 μg / ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) pikeun tilu passages kahiji salaku pilihan stringent handap.Lajeng dipaké 20 μg / ml salaku regimen leuwih stringent pikeun tilu passages salajengna.
Sél dibibita dina 12-well chambers (Ibidi, #81201) dina kapadetan kira-kira 20.000 sél per sumur.Pikeun ningkatkeun adhesi sél HEK293T, tambahkeun 50 µg/ml fibronektin (Corning, #356008) éncér dina saline buffered fosfat (PBS, Sangon, #B640435) dina suhu 37°C.The chambers anu pretreated pikeun 1 jam lajeng dikaluarkeun kalawan PBS.Saatos 24 jam, sél dikumbah sakali nganggo PBS, diinkubasi ku 1 mM usik 3 dina larutan uyah saimbang Hanks seger (HBSS, Gibco, #14025092) salami 1 jam dina 37 ° C, teras diinkubasi ku LED biru (460 nm). ).) diiradiasi salila 10 menit dina suhu kamar.Saatos éta, sél dikumbah dua kali nganggo PBS sareng dibenerkeun ku formaldehida 4% dina PBS (Sangon, #E672002) salami 15 menit dina suhu kamar.Kaleuwihan formaldehida dipiceun tina sél tetep ku cara ngumbah tilu kali nganggo PBS.Sél ieu lajeng permeabilized kalawan 0,5% Triton X-100 (Sangon, # A600198) dina PBS sarta dikumbah 3 kali kalawan PBS.Teras cabut chamber sareng tambahkeun ka unggal sampel 25 µl campuran réaksi klik anu ngandung 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) jeung 0,5 mg / ml natrium askorbat (Aladdin, No. S105024) sarta incubated pikeun 30 menit dina suhu kamar.Saatos réaksi jepret, sél dikumbah genep kali kalayan PBS anu ngandung 0,05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) teras diblokir ku 5% BSA (Abcone, #B24726) dina PBST salami 30 menit dina suhu kamar.
Pikeun immunostaining kolokalisasi, sél diinkubasi ku antibodi primér dumasar kana kaayaan anu dituduhkeun: mouse anti-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), kelenci anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), kelenci polyclonal anti-calnexin antibodi (1:500, Abcam, #ab22595) atawa kelenci anti-lamin A / C antibodi monoclonal (1:500; CST, #2032) dina 4 °C sapeuting.Saatos ngumbah 3 kali kalayan PBST, sél ieu incubated kalawan antibodi sekundér: embe anti kelenci Alexa Fluor 488 (Thermo, # A11034) diluted 1:1000, embe anti mouse Alexa Fluor 594 (CST, #8889) diluted 1:1000.éncér Éncér dina suhu kamar pikeun 30 menit.Sél lajeng dikumbah 3 kali kalawan PBST sarta counterstained kalawan DAPI (Thermo, #D1306) dina PBS pikeun 10 menit dina suhu kamar.Saatos 3 washes kalawan PBS, sél ieu disegel dina 50% gliserol (Sangon, # A600232) dina PBS pikeun Imaging.Gambar immunofluoresensi dicandak nganggo mikroskop confocal ZEISS LSM 900 Airyscan2 sareng parangkat lunak ZNE 3.5.
Pikeun pencitraan fluoresensi oksigén singlet, sél dikumbah dua kali nganggo panyangga Hanks HEPES sateuacan nambihan 100 nM Si-DMA dina panyangga Hanks HEPES (DOJINDO, #MT05).Saatos kakeunaan cahaya, sél-sél diinkubasi dina inkubator CO2 dina suhu 37 ° C salami 45 menit.Sél lajeng dikumbah dua kali ku panyangga HEPES Hanks sarta counterstained kalawan Hoechst dina panyangga HEPES Hanks pikeun 10 menit dina suhu kamar tur visualized maké ZEISS LSM 900 mikroskop confocal., #M36008) dina panyangga HBSS anu ngandung kalsium sareng magnesium.Saatos paparan ka lampu atawa doxorubicin (MCE, #HY-15142A), sél anu incubated dina incubator CO2 dina 37 ° C. keur 10 menit, dikumbah dua kali kalawan panyangga HBSS, sarta incubated kalawan Hoechst dina panyangga HBSS dina suhu kamar.menit.Doxorubicin dipaké salaku kontrol usik positif dimana sél dirawat kalayan 20 μM doxorubicin dina HBSS ngandung 1% BSA pikeun 30 mnt.Gambar immunofluoresensi dicandak nganggo mikroskop confocal Zeiss LSM 900.
Sél HEK293T sacara stabil nganyatakeun mito-miniSOG diturunkeun dina kapadetan kira-kira 30% dina piring 15 cm.Saatos 48 jam, nalika ~ 80% confluence ieu ngahontal, sél anu dikumbah sakali kalawan PBS, incubated kalawan 1 mM Probe 3 dina panyangga HBSS seger pikeun 1 jam dina 37 ° C lajeng cahayana ku LED biru keur 10 menit di kamar. suhu..Saatos éta, sél dikumbah dua kali nganggo PBS, dikerok sareng digantungkeun deui dina panyangga PBS és-tiis anu ngandung sambetan protease bébas EDTA (MCE, #HY-K0011).Sél anu lysed ku sonicating tip pikeun 1 menit (1 detik on na 1 detik kaluar dina 35% amplitudo).Campuran anu dihasilkeun ieu centrifuged dina 15,871 xg pikeun 10 mnt dina 4 ° C pikeun miceun lebu, sarta konsentrasi supernatant ieu disaluyukeun kana 4 mg / ml ngagunakeun BCA protéin assay kit (Beyotime, #P0009).Ngagabungkeun 1 ml lysate luhur kalawan 0,1 mM photodegradable biotin azide (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM TBTA ligan (Aladdin, #T162437), sarta 1 mM CuSO4 incubator kalawan handap. rotasi nepi ka 1 jam dina suhu kamar.Saatos réaksi jepret, tambahkeun campuran kana larutan anu tos dicampur (MeOH: CHCl3:H2O = 4 ml: 1 ml: 3 ml) dina vial kaca 10 ml.Sampel dicampur sareng disentri dina 4500 g salami 10 menit dina suhu kamar.Solusi handap sareng luhur dipiceun, endapanana dikumbah dua kali kalayan 1 ml métanol sareng disentrifugasi dina 15871 × g salami 5 menit dina 4 ° C.Tambahkeun 1 ml 8 M uréa (Aladdin, no. U111902) dina 25 mM amonium bikarbonat (ABC, Aladdin, No. A110539) pikeun ngabubarkeun endapanana.Sampel reconstituted kalawan 10 mM dithiothreitol (Sangon, # A100281 dina 25 mM ABC) pikeun 40 menit dina 55 ° C dituturkeun ku tambahan 15 mM iodoacetamide seger (Sangon, # A600539) dina suhu kamar di nu poek.Alkilasi dina 30 menit..Tambahan 5 mM dithiothreitol ditambahkeun pikeun ngeureunkeun réaksina.Nyiapkeun kira-kira 100 µl NeutrAvidin agarose manik (Thermo, #29202) pikeun tiap sampel ku cara ngumbah 3 kali kalayan 1 ml PBS.Solusi proteome di luhur éncér sareng 5 ml PBS sareng diinkubasi ku manik agarose NeutrAvidin tos dikumbah salami 4 jam dina suhu kamar.Manik-manik ieu lajeng dikumbah 3 kali kalawan 5 ml PBS ngandung 0,2% SDS (Sangon, #A600485), 3 kali kalawan 5 ml PBS ngandung 1M uréa, sarta 3 kali kalawan 5 ml ddH2O.Manik-manik ieu lajeng dipanén ku sentrifugasi sarta resuspended dina 200 μl 25 mM ABC ngandung 1 M urea, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) jeung 20 ng / μl trypsin (Promega, #V5280).Trypsinize sapeuting dina 37 ° C kalayan rotasi.Réaksi ieu dieureunkeun ku nambahkeun asam format (Thermo, # A117-50) nepi ka pH ngahontal 2-3.Manik dikumbah 3 kali kalayan 1 ml PBS anu ngandung 0,2% SDS, 3 kali kalayan 1 ml PBS anu ngandung 1 M uréa, teras 3 kali kalayan 1 ml cai sulingan.Péptida anu dirobih dileupaskeun ku lisis cahaya (365 nm) salami 90 menit nganggo 200 μl 70% MeOH.Saatos sentrifugasi, supernatant dikumpulkeun.Manik-manik ieu lajeng dikumbah sakali kalawan 100 μl of 70% MeOH sarta supernatants anu pooled.Sampel dikeringkeun dina konsentrator vakum Speedvac sareng disimpen dina -20 ° C dugi ka analisa.
Pikeun ngaidentipikasi sareng ngitung péptida anu dirobih oksigén singlet, conto dibubarkeun deui dina asam format 0.1% sareng 1 μg péptida dianalisis nganggo spéktrométer massa Orbitrap Fusion Lumos Tribrid anu dilengkepan sumber nano ESI ti Tune sareng Xcalibur tina parangkat lunak vendor 4.3.Sampel dipisahkeun dina kolom kapilér 75 µm × 15 cm anu dibungkus sacara internal kalayan bahan C18 3 µm (ReproSil-pur, #r13.b9.) sareng dihubungkeun sareng sistem EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).Péptida dipisahkeun ku kromatografi gradién 95 menit linier tina 8% pangleyur B nepi ka 50% pangleyur B (A = 0.1% asam format dina cai, B = 0.1% asam format dina 80% acetonitril), tuluy ngaronjat linier jadi 98% B mnt. dina 6 mnt dina laju aliran 300 nl / mnt.Orbitrap Fusion Lumos ngumpulkeun data silih ganti antara scan MS lengkep sareng scan MS2 gumantung kana data.Tegangan sputtering disetel ka 2.1 kV jeung suhu kapilér transpor ion éta 320 ° C.MS spéktra (350-2000 m/z) dikumpulkeun kalawan resolusi 120.000, AGC 4 × 105, jeung waktu input maksimum 150 mdet.10 prékursor muatan multiply anu paling umum dina unggal scan pinuh dipisahkeun nganggo HCD kalayan énergi tabrakan anu dinormalisasi 30%, jandela isolasi quadrupole 1,6 m/z, sareng setting resolusi 30,000.Target AGC pikeun spéktrométri massa tandem nganggo 5 × 104 sareng waktos input maksimal 150 mdet.Pangecualian dinamis disetel ka 30 detik. Ion anu henteu ditugaskeun atanapi anu muatanana 1+ sareng> 7+ ditolak pikeun MS/MS. Ion anu henteu ditugaskeun atanapi anu muatanana 1+ sareng> 7+ ditolak pikeun MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ jeung > 7+ были отклонены для МС/МС. Ion atanapi ion anu teu ditugaskeun kalayan muatan 1+ sareng> 7+ ditolak pikeun MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于 MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于 MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ jeung > 7+ были отклонены для МС/МС. Ion atawa ion anu teu ditangtukeun kalawan muatan 1+ jeung > 7+ ditolak keur MS/MS.
Data atah diolah nganggo platform komputasi FragPipe dumasar kana MSFragger.Bias massa sareng asam amino saluyu ditetepkeun nganggo algoritma milarian kabuka kalayan kasabaran massa prékursor -150 dugi ka 500 Da.Péptida dirobah lajeng diidentifikasi maké modifikasi histidine kalawan gains massa +229.0964 na +247.1069 Da di PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Sél anu sacara stabil nganyatakeun gén miniSOG anu ngahiji dilapis dina piring 6 cm.Kana ngahontal ~ 80% confluence, sél anu dikumbah sakali kalawan HBSS (Gibco, #14025092), lajeng incubated kalawan panyilidikan kimiawi di HBSS pikeun 1 jam dina 37 ° C sarta cahayana ku lampu biru.10W LED pikeun 20 menit dina suhu kamar.Pikeun nangtukeun jenis spésiés oksigén réaktif mana anu kalibet dina PDPL, 0,5 mM vitamin C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 mM mannitol (Énergi Kimia, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 ditambahkeun kana sél salaku suplemén.Saatos ngumbah kalawan PBS tiis, sél anu scraped, dikumpulkeun dina 1,5 ml tabung centrifuge, sarta sonicated kalawan tip pikeun 1 mnt di 200 μl PBS kalawan 1x inhibitor protease tanpa EDTA (1 s jeung 1 s tanpa, amplitudo 35%).Campuran hasilna ieu centrifuged dina 15.871 × g pikeun 10 mnt dina 4 ° C jeung konsentrasi supernatant ieu disaluyukeun kana 1 mg / mL maké BCA protéin assay kit.Kira-kira 50 µl lysate di luhur diinkubasi sareng 0.1 mM rhodamine azide (Aladdin, No. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligan, sareng 1 mM CuSO4 salami 1 jam dina suhu kamar kalayan rotasi ti handap ka luhur.Saatos réaksi klik, présipitasi sareng aseton dilaksanakeun ku cara nambihan 250 μl aseton tos tiis kana conto, inkubasi dina -20 ° C salami 20 mnt sareng sentrifugasi dina 6010 × g salami 10 menit dina 4 ° C.Kumpulkeun pelet sareng kulub dina 50 µl 1x panyangga Laemmli salami 10 menit dina 95 °C.Sampel teras dianalisis dina gels panjang SDS-PAGE sareng ditingali nganggo sistem pencitraan Bio-rad ChemiDoc MP Touch kalayan parangkat lunak Image Lab Touch.
Ekspresi sareng purifikasi protéin miniSOG-6xHis rékombinan dilakukeun sapertos anu dijelaskeun sateuacana.Sakeudeung, E. coli BL21 (DE3) sél (TransGen, # CD701-02) dirobah kalawan pET21a-miniSOG-6xHis jeung ekspresi protéin ieu ngainduksi ku 0,5 mM IPTG (Sangon, # A600168).Saatos lisis sél, protéin dimurnikeun maké Ni-NTA agarose manik (MCE, No. 70666), dialisis ngalawan PBS, sarta disimpen dina -80 ° C.
Pikeun tés jarak labél in vitro basis antibodi, campur 100 μM miniSOG dimurnikeun, 1 mM usik 3, sareng 1 μg anti labél mouse antibodi monoklonal (TransGen, #HT501-01) dina PBS kana volume réaksi total 50 μl..Campuran réaksi ieu disinari ku lampu LED biru pikeun 0, 2, 5, 10, jeung 20 mnt dina suhu kamar.Campuran ieu diinkubasi sareng 0.1 mM biotin-PEG3-azide (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligan, sareng 1 mM CuSO4 salami 1 jam dina suhu kamar dina shaker gerak ka luhur.Saatos réaksi jepret, tambahkeun 4x panyangga Laemmli langsung kana campuran sareng kulub dina 95 ° C salami 10 mnt.Sampel dianalisis dina gels SDS-PAGE sarta dianalisis ku blotting barat kalawan streptavidin-HRP (1: 1000, Solarbio, # SE068).
Péptida sintétik anu ngandung histidin sareng C-terminal amidation (LHDALDAK-CONH2) dianggo pikeun nganalisis labél in vitro dumasar péptida caket dieu.Dina assay ieu, 100 μM miniSOG dimurnikeun, 10 mM usik 3 jeung 2 μg / ml péptida sintétik dicampurkeun dina PBS dina total volume réaksi 50 μl.Campuran réaksi ieu disinari ku lampu LED biru salila 1 jam dina suhu kamar.Hiji microliter sampel dianalisis ngagunakeun sistem LC-MS (Waters, SYNAPT XS Ions Mobilitas Time-of-Flight spéktrométer massa kalayan software analisis spéktrum MassLynx).
Sél HEK293T sacara stabil nyatakeun gén fusi miniSOG diturunkeun dina piring 10 cm pikeun garis kalayan lokalisasi organél anu béda (Mito, ER, Nucleus) sareng piringan 15 cm pikeun garis Parkin-miniSOG sareng BRD4-miniSOG.Kana ngahontal ~ 90% confluence, sél anu dikumbah sakali kalawan HBSS, lajeng incubated kalawan usik 3 di HBSS pikeun 1 jam dina 37 ° C sarta cahayana ku LED biru 10 W dina suhu kamar.Pikeun panyiri non-kontak Parkin, 10 µM proton carbonyl cyanide carrier m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) kalayan usik 3 dina HBSS ditambahkeun pikeun 1 jam dina 37°C.Léngkah lisis sél, kimia klik, réduksi sareng alkilasi sami sareng anu ditétélakeun di luhur, kecuali 2 mg lysate ditambah sareng biotin PEG3 azide dianggo dina réaksi klik tinimbang biotin azide anu tiasa didegradasi.Sanggeus pengayaan, manik dikumbah 3 kali kalayan 5 ml PBS anu ngandung 0,2% SDS, 3 kali kalayan 5 ml PBS anu ngandung 1 M urea, sareng 3 kali kalayan 5 ml PBS.Saterusna, 2 µg tripsin ditambahkeun kana 300 µl 25 mM ABC ngandung 1 M uréa pikeun meulah protéin sapeuting dina 37 ° C.Réaksi dieureunkeun ku nambahkeun asam format nepi ka pH 2-3 ngahontal.Saatos trypsinization on manik, solusi péptida ieu desalted maké kolom SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) jeung garing dina konsentrator vakum Speedvac.Péptida dibubarkeun deui dina 0,1% asam format sareng 500 ng péptida dianalisis nganggo spéktrométer massa Orbitrap Fusion Lumos Tribrid anu dilengkepan ku sumber nano-ESI anu dijelaskeun di luhur.Péptida dipisahkeun dina precolumns RP-HPLC komérsial (75 μm x 2 cm) (Thermo, No. 164946) jeung kolom RP-HPLC analitik (75 μm x 25 cm) (Thermo, No. 164941), duanana ngeusi 2 μm.gradién ti 8% nepi ka 35% ACN dina 60 menit, lajeng linearly ngaronjat nepi ka 98% B dina 6 menit dina laju aliran 300 Nl / mnt.MS spéktra (350-1500 m/z) dikumpulkeun kalawan resolusi 60.000, AGC 4 × 105, jeung waktu input maksimum 50 mdet.Ion anu dipilih sacara sekuen dipisahkeun ku HCD dina siklus 3 detik kalayan énergi tabrakan anu dinormalisasi 30%, jandela isolasi quadrupole 1,6 m / z, sareng résolusi 15000. A 5 × 104 tandem spéktrométer massa target AGC sareng waktos suntikan maksimum. ti 22 ms dipaké.Pangaluaran dinamis disetel ka 45 detik. Ion anu henteu ditugaskeun atanapi anu muatanana 1+ sareng> 7+ ditolak pikeun MS/MS. Ion anu henteu ditugaskeun atanapi anu muatanana 1+ sareng> 7+ ditolak pikeun MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ jeung > 7+ были отклонены для МС/МС. Ion atanapi ion anu teu ditugaskeun kalayan muatan 1+ sareng> 7+ ditolak pikeun MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于 MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于 MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ jeung > 7+ были отклонены для МС/МС. Ion atawa ion anu teu ditangtukeun kalawan muatan 1+ jeung > 7+ ditolak keur MS/MS.
Persiapan sampel léngkah nepi ka pengayaan tina manik NeutrAvidin éta sarua dina analisis LC-MS / MS ditétélakeun di luhur.Kira-kira 50 μg lysate dipaké salaku input pikeun loading control jeung 2 mg lysate dipaké pikeun réaksi klik.Saatos pengayaan sareng dikumbah ku neutravidin, protéin anu kabeungkeut diélusi ku cara nambihan 50 μl panyangga Laemmli kana manik résin agarose sareng ngagolakkeun dina 95 ° C salami 5 menit.Input beban kontrol jeung sampel enriched manik dianalisis ku SDS-PAGE sarta dipindahkeun ka mémbran PVDF (Millipore, #ISEQ00010) ku métode Western blot baku.Mémbran diblokir ku 5% susu skim (Sangon, #A600669) dina TBS ngandung 0,1% tween-20 (TBST) sarta inkubasi sequentially kalawan antibodi primér sarta sekundér.Antibodi primér éncér 1: 1000 dina susu skim 5% dina TBST sareng diinkubasi sapeuting dina suhu 4 ° C.Antibodi sekundér digunakeun dina nisbah 1:5000 sareng diinkubasi salami 1 jam dina suhu kamar.Mémbran ditingali ku chemiluminescence nganggo sistem pencitraan Chemidoc MP.Kabéh scan uncut of blots na gél dina gambar dibere salaku data atah.
Antibodi primér dipaké dina ulikan ieu kaasup kelenci anti SFPQ antibodi monoklonal (CST, No. 71992), kelenci anti FUS antibodi monoklonal (CST, No. 67840), kelenci anti NSUN2 antibodi polyclonal (Proteintech, No. 20854-1- AP), kelenci anti-mSin3A antibodi poliklonal (Abcam, #ab3479), mouse anti-tag antibodi monoklonal (TransGen, #HT201-02), mouse anti-β-actin antibodi monoklonal (TransGen, #HC201-01), kelenci anti -CDK2 antibodi monoklonal (ABclonal, #A0094), kelenci antibodi monoklonal ka CTBP1 (ABclonal, #A11600), kelenci polyclonal antibodi pikeun DUT (ABclonal, #A2901), kelenci antibodi polyclonal ka PSMC4 (ABclonal, #A2505), kelenci anti- DNAJB1 antibodi poliklonal (ABclonal, # A5504).Antibodi ieu dipaké dina éncér 1:1000 dina susu skim 5% dina TBST.Antibodi sekundér anu digunakeun dina ulikan ieu kalebet anti kelenci IgG (TransGen, #HS101-01), anti-mouse IgG (TransGen, #HS201-01) dina éncér 1:5000.
Pikeun nalungtik salajengna naha BRD4 berinteraksi sareng SFPQ, stabil HEK293T na BRD4-miniSOG sél overexpressing HEK293T plated dina piring 10 cm.Sél dikumbah ku PBS tiis sareng dilisekeun dina 1 ml Pierce IP lysis buffer (Thermo Fisher, #87787) kalayan inhibitor protease bébas EDTA salami 30 menit dina 4 ° C.Saatos éta, lysates dikumpulkeun dina tabung centrifuge 1,5 ml sareng disentri dina 15,871 xg salami 10 menit dina 4 ° C.Supernatan dipanén sareng diinkubasi ku 5 µg anti-V5 anu dilabélan antibodi monoklonal beurit (CST, #80076) sapeuting dina suhu 4 ° C.Cuci sakitar 50 µl protéin A/G manik magnét (MCE, #HY-K0202) dua kali nganggo PBS anu ngandung 0,5% Tween-20.Lajeng lysates sél ieu incubated kalawan manik magnét salila 4 jam dina 4 ° C kalayan rotasi ti handap ka luhur.Lajeng manik dikumbah opat kali kalawan 1 ml PBST panyangga jeung pindang dina 95 ° C salila 5 mnt.Sampel dianalisis dina gels SDS-PAGE sarta dipindahkeun ka mémbran PVDF ngagunakeun métode Western blot baku.Mémbran diblokir dina susu skim 5% dina TBST sareng diinkubasi sacara berurutan sareng antibodi primér sareng sekundér.Antibodi primér Rabbit anti-SFPQ antibodi monoklonal (CST, #71992) digunakeun dina nisbah 1:1000 dina susu skim 5% dina TBST sareng diinkubasi sapeuting dina suhu 4°C.IgG anti kelenci dipaké dina nisbah 1:5000 sarta diinkubasi salila 1 jam dina suhu kamar.Mémbran ditingali ku chemiluminescence nganggo sistem pencitraan Chemidoc MP.
Sadaya struktur anu dianggo pikeun analisis Pangleyur Diaksés Surface Area (SASA) dicandak tina Protein Data Bank (PDB)52 atanapi AlphaFold Protein Structure Database53.SASA mutlak diitung keur unggal résidu ngagunakeun program FreeSASA.Ngan data SASA lengkep jeung unambiguous pikeun histidine dilabélan jeung tatanggana dipaké pikeun ménta rata SASA pikeun tiap struktur.Aksesibilitas pangleyur relatif (RSA) pikeun tiap histidin diitung ku ngabagi nilai SASA mutlak ku aréa permukaan résidu maksimum maksimum empiris sadia pikeun pangleyur.Sadaya histidin teras digolongkeun disumputkeun upami rata-rata RSA sahandapeun 20%, upami henteu kakeunaan56.
File atah diala dina modeu DDA searched maké Proteome Discoverer (v2.5) atanapi MSfragger (Fragpipe v15.0) dina database protéin diverifikasi SwissProt luyu ngandung rereged umum.Péptida ngabutuhkeun tripsin lengkep sareng dua situs pembelahan anu leungit, métilasi carbamoyl salaku modifikasi tetep sareng oksidasi metionin salaku modifikasi dinamis.Toléransi beurat prékursor sareng sempalan disetel ka 10 ppm sareng 0.02 Da (MS2 Orbitrap) masing-masing. Kontaminan hits dihapus, sarta protéin disaring pikeun ménta laju kapanggihna palsu <1%. Kontaminan hits dihapus, sarta protéin disaring pikeun ménta laju kapanggihna palsu <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэффициент ложного %. Kontaminasi pencét dipiceun sareng protéin disaring pikeun masihan tingkat deteksi palsu <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаружены. Kontaminasi hits dileungitkeun sareng protéin disaring pikeun ngahontal tingkat positip palsu <1%.Pikeun analisis kuantitatif tanpa ngagunakeun labél, eusi protéin dinormalisasi tina tilu ulangan biologis dipaké.Analisis lokalisasi subsélular protéin dilakukeun nganggo analisis Gene Ontology (GO) ti DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 sareng database anu disusun sareng diterbitkeun ku grup Alice Ting.Peta gunung seuneuan dicandak ti Perseus (v1.6.15.0). Parobahan lipetan kelimpahan protéin diuji pikeun signifikansi statistik nganggo t-test dua sisi, sareng protéin hits diidentipikasi ku parobahan kaayaanana> 2 (iwal disebutkeun béda) sareng nilai p <0.05. Parobahan lipetan kelimpahan protéin diuji pikeun signifikansi statistik nganggo t-test dua sisi, sareng protéin hits diidentipikasi ku parobahan kaayaanana> 2 (iwal disebutkeun béda) sareng nilai p <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Parobahan lipetan eusi protéin diuji pikeun signifikansi statistik ngagunakeun t-test dua-buntut, sareng patandingan protéin diidentipikasi ku parobahan eusi> 2 (iwal mun disebutkeun béda) jeung nilai ap <0.05.使用 双边 T 检验 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 变化 的 的显着性, 并并 确定 确定 蛋白质 中 的> 2 (除非 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值).使用 双边 T 检验 测试 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 的 统计 显着性 并 确定 确定 蛋白质 命 命 中 的> 2 (另 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值). Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Signifikansi statistik parobahan lipetan eusi protéin diuji maké t-test dua-buntut, sarta patandingan protéin ditangtukeun pikeun parobahan eusi> 2 (iwal disebutkeun béda) jeung p-nilai <0.05.Analisis interaksi protéin dilaksanakeun nganggo analisis GO sareng database String.
Tilu ulangan biologis dilaksanakeun kalayan hasil anu sami.Analisis statistik dilakukeun ku GraphPad Prism (software GraphPad) sareng plot gunung seuneuan dihasilkeun ku Perseus (v1.6.15.0).Pikeun ngabandingkeun dua grup, p-nilai ditangtukeun ngagunakeun dua-buntut murid t-test.Ngan protéin singleton anu diidentifikasi sahenteuna dua kali dina grup ékspérimén anu kalebet dina plot gunung seuneu, sareng nilai-nilai anu leungit dina kelompok kontrol diganti ku Perseus tina distribusi normal supados nilai-p tiasa diitung.Bar kasalahan ngagambarkeun mean ± simpangan baku.Dina analisa proteomik pikeun analisa statistik, kelimpahan protéin anu muncul dina sahenteuna dua ulangan biologis dipikagaduh.Métode statistik teu dipaké pikeun pre-nangtukeun ukuran sampel.Percobaan henteu acak.Para panalungtik teu buta kana tugas salila percobaan sarta evaluasi hasil.
Kanggo inpo nu langkung lengkep ihwal desain ulikan, tingali abstrak Laporan Panalungtikan Alam numbu ka artikel ieu.
Data spéktrométri massa diala dina ulikan ieu dikintunkeun ka Konsorsium ProteomeXchange via gudang mitra iProX57 handapeun dataset ID PXD034811 (dataset PDPL-MS).Data atah disayogikeun dina bentuk file data atah.Artikel ieu nyadiakeun data aslina.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Ngauningaan lingkungan: ngagunakeun biotinilasi-gumantung deukeut ka characterize kompléx protéin jeung organél peta. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Ngauningaan lingkungan: ngagunakeun biotinilasi-gumantung deukeut ka characterize kompléx protéin jeung organél peta.Gingras, AS, Abe, KT na Raut, B. Familiarity kalawan sakuliling: ngagunakeun biotinilasi-gumantung deukeut ka characterize kompléx protéin jeung organél peta. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物并细。 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Ngartos lingkungan: ngagunakeun katergantungan lingkungan dina kahirupan biologis.Gingras, AS, Abe, KT jeung Raut, B. Ngarti deukeutna: characterization kompléx protéin jeung pemetaan organél ngagunakeun biotinylation gumantung deukeut.ayeuna.pendapat abdi.Kimia.biologi 48, 44-54 (2019).
Geri, JB et al.Mapping microenvironment ku mindahkeun énergi Dexter ka sél imun.Élmu 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.Jaringan skala dua-proteome ngadeteksi remodeling sél-spésifik tina interaksi manusa.Sél 184, 3022–3040.e3028 (2021).